【摘要】：陰道毛滴蟲(chóng)(Trichomonas vaginalis,TV)是寄生在人體泌尿生殖系統(tǒng)的寄生性原蟲(chóng)。它不僅能夠引起女性滴蟲(chóng)性陰道炎和宮頸炎、男性尿道炎和前列腺炎,還可以感染小鼠和松鼠猴。呈世界性分布,是一種危害人獸健康的重要人獸共患寄生性原蟲(chóng)。目前,尚無(wú)有效的防治方法,究其原因是由于對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)的細(xì)胞分子生物學(xué)特性的研究較少。而端粒是存在于真核細(xì)胞染色體末端的DNA重復(fù)序列與一些相關(guān)蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu),由端粒酶進(jìn)行調(diào)控。端粒及其相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)成為分子生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。在大多數(shù)真核生物中,包括原蟲(chóng),如賈第蟲(chóng),微小隱孢子蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)及布氏錐蟲(chóng)等端粒DNA重復(fù)序列及端粒相關(guān)蛋白均有研究。但是作為真核生物分支早期的陰道毛滴蟲(chóng),其端粒DNA重復(fù)序列的研究未見(jiàn)報(bào)道,通過(guò)生物信息學(xué)分析在陰道毛滴蟲(chóng)基因組中并沒(méi)有端粒酶序列。那么是什么對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)端粒DNA的延伸進(jìn)行調(diào)節(jié)。為此,本試驗(yàn)將對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)端粒DNA及其調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行研究。具體如下:端粒DNA重復(fù)序列鑒定:利用S1核酸酶及Mbo I限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)基因組DNA切割并與pUC18載體相連后測(cè)序得出重復(fù)序列(TTTTAGGG)_n,長(zhǎng)度約在2000 bp。通過(guò)BAL31核酸酶消化和FISH證明了該重復(fù)序列能夠定位于陰道毛滴蟲(chóng)染色體末端,是陰道毛滴蟲(chóng)的端粒DNA重復(fù)序列。端粒DNA與端粒結(jié)合蛋白TRF和TBP相互作用研究:應(yīng)用原核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建端粒結(jié)合蛋白pET-TRF和pET-TBP原核表達(dá)載體,以Western blot及IIF和FISH聯(lián)合試驗(yàn)對(duì)TRF和TBP在陰道毛滴蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)定位,EMSA研究TRF和TBP在體外與端粒DNA結(jié)合作用。Western blot結(jié)果顯示TRF和TBP均在細(xì)胞核中表達(dá),是一種低表達(dá)的核蛋白。IIF和FISH聯(lián)合試驗(yàn)證明了TRF和TBP都能夠與端粒DNA呈點(diǎn)狀部分共定位于陰道毛滴蟲(chóng)細(xì)胞核染色體末端。EMSA中阻滯條帶表明了兩者均能夠在體外與雙鏈端粒DNA結(jié)合。端粒結(jié)合蛋白TRF和TBP對(duì)端粒DNA的影響:分別構(gòu)建針對(duì)TRF和TBP的錘頭狀核酶TRF-HR和TBP-HR研究端粒結(jié)合蛋白TRF和TBP分別在體內(nèi)對(duì)端粒DNA延伸的影響。體外切割試驗(yàn)得出TRF-HR和TBP-HR能夠有效的對(duì)TRF和TBP的體外轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行切割,其效率分別為89.4%和92.1%。經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染后熒光定量PCR檢測(cè)出TRF-HR和TBP-HR同樣能夠在體內(nèi)對(duì)TRF和TBP進(jìn)行切割,切割效率分別為82.6%及85.2%。Western blot分析顯示TRF和TBP在蛋白質(zhì)水平上也明顯減少。通過(guò)Southern blot檢驗(yàn)得出,在TRF和TBP減少時(shí),端粒DNA重復(fù)序列長(zhǎng)度反而增加,即陰道毛滴蟲(chóng)TRF和TBP對(duì)端粒DNA延伸起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。SPP對(duì)端粒DNA的影響:應(yīng)用原核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建SPP原核表達(dá)載體pET-SPP,經(jīng)EMSA研究SPP在體外與端粒DNA結(jié)合作用。構(gòu)建錘頭狀核酶SPP-HR研究SPP在體內(nèi)對(duì)端粒DNA延伸的影響。EMSA中阻滯條帶表明了SPP能夠在體外與雙鏈端粒DNA結(jié)合。錘頭狀核酶SPP-HR體外切割試驗(yàn)得出SPP-HR對(duì)SPP的體外轉(zhuǎn)錄體的切割效率為89.5%。電穿孔轉(zhuǎn)染至陰道毛滴蟲(chóng)體內(nèi),熒光定量PCR分析表明SPP-HR仍能在體內(nèi)對(duì)SPP進(jìn)行切割,切割效率為84.6%。Western blot檢測(cè)得到SPP在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上也明顯減少。經(jīng)Southern blot檢驗(yàn)得出,在SPP mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低時(shí),端粒DNA重復(fù)序列長(zhǎng)度也隨之縮短,表明SPP對(duì)端粒DNA延伸起到正調(diào)節(jié)作用。PIKK與SPP相互作用及PIKK對(duì)端粒DNA的影響:構(gòu)建pGEX-PIKK原核表達(dá)載體及含有陰道毛滴蟲(chóng)α-SCSB啟動(dòng)子的BiFC載體,采用GST-Pull down和BiFC試驗(yàn)研究PIKK和SPP兩者之間的相互作用。構(gòu)建錘頭狀核酶PIKK-HR研究PIKK在體內(nèi)對(duì)端粒DNA延伸的影響。GST-pull down結(jié)果中能夠看到重組PIKK和SPP蛋白相互結(jié)合條帶。BiFC試驗(yàn)更加直觀的檢測(cè)到紅色熒光,從而確定了PIKK和SPP在陰道毛滴蟲(chóng)體內(nèi)外均存在相互作用。錘頭狀核酶PIKK-HR體外切割試驗(yàn)得出PIKK-HR對(duì)PIKK的體外轉(zhuǎn)錄體的切割效率為91.2%。電穿孔轉(zhuǎn)染至陰道毛滴蟲(chóng)體內(nèi),熒光定量PCR分析表明PIKK-HR能在體內(nèi)對(duì)PIKK進(jìn)行切割,切割效率為86.7%。Western blot檢測(cè)得到PIKK在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上也明顯減少。經(jīng)Southern blot檢驗(yàn)得出,在PIKK蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低時(shí),端粒DNA重復(fù)序列長(zhǎng)度也隨之縮短,說(shuō)明PIKK對(duì)端粒DNA延伸起到正調(diào)節(jié)作用。綜上試驗(yàn)研究表明,在不存在端粒酶的情況下,陰道毛滴蟲(chóng)端粒DNA重復(fù)序列(TTTTAGGG)_n的延伸受到端粒結(jié)合蛋白TRF和TBP的負(fù)調(diào)節(jié),以及SPP和PIKK的正調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步研究陰道毛滴蟲(chóng)端粒調(diào)控機(jī)制、陰道毛滴蟲(chóng)分子生物學(xué)特性及陰道毛滴蟲(chóng)永生化等方面提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.72
【圖文】：

交：將已變性的探針滴加于標(biāo)本蓋玻片上滌：將標(biāo)本蓋玻片加入已預(yù)熱的 50 %甲酰預(yù)熱的 1×SSC 中洗滌 3 次，每次 5 min。核：DAPI 對(duì)細(xì)胞核染色 5 min，用 PBST片及鏡檢：滴加封片劑后，置于載玻片上滴蟲(chóng)基因組 DNA 提取培養(yǎng)，收集陰道毛滴蟲(chóng)提取總 DNA，進(jìn)道毛滴蟲(chóng)基因組 DNA 條帶清晰，可進(jìn)行1 2

BAL31 核酸酶消化鑒定以(TTTTAGGG)5設(shè)計(jì)為地高辛標(biāo)記探針，將陰道毛滴蟲(chóng)基因組 DNA 間(0、20、40、60、80 min)BAL31 核酸酶及 Mbo I 消化后，與探針雜uthern blot，如圖 1-3 顯示，隨著時(shí)間的增加，端粒 DNA 序列逐漸降低圖 1-2 陰道毛滴蟲(chóng)(TTTTAGGG)n重復(fù)序列Fig 1-2 The highly repetitive sequence (TTTTAGGG)nof T.vaginalis.

Southernblot分析

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本文編號(hào)：2759317