【摘要】：貓皰疹病毒I型(Feline herpesvirus-1,FHV-1)是貓傳染性鼻氣管炎的病原體,可引起貓科動物急性、高度接觸性上呼吸道疾病。FHV-1屬于皰疹病毒科,甲型皰疹病毒亞科成員,為雙股DNA病毒。FHV-1隱性感染和感染后康復的貓能長期帶毒和排毒,成為傳染源。同其他皰疹病毒一樣,FHV-1可潛伏在貓的三叉神經(jīng)節(jié),并在貓免疫力低下時再激活而導致發(fā)病,給該病的防控造成困難。因此,加強對國內(nèi)FHV-1流行毒株的分離鑒定及診斷方法的建立對該病的防控具有重要意義。本研究首先從病貓眼鼻拭子中分離病毒,進行一系列鑒定。結(jié)果表明該分離株可在CRFK細胞上產(chǎn)生典型CPE,病毒滴度可達到10~8 TCID_(50)/mL。電鏡下觀察到圓形、有囊膜、直徑大小約150 nm的病毒顆粒。提取病毒基因組,擴增gD基因,得到一條1125 bp大小的特異性條帶,經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)其與標準毒株FHV-1 C-27 gD基因序列相似性達100%,表明該分離株為FHV-1,命名為HR-1。IFA結(jié)果顯示接種HR-1的CRFK細胞出現(xiàn)特異性熒光。動物回歸試驗結(jié)果顯示,HR-1感染家貓后,臨床主要表現(xiàn)為眼結(jié)膜炎和鼻氣管炎;病理切片發(fā)現(xiàn)肺臟上皮細胞組織增生,腎小管上皮細胞空泡化、壞死等;利用Real-time qPCR方法,能從感染貓的眼、鼻拭子中檢測到病毒核酸,且在感染后第4-6天病毒載量達到最高峰,同時證明HR-1在三叉神經(jīng)中可以復制。HR-1對家貓的致死率可達100%,表明HR-1對家貓有較強的致病性。其次,選取高度保守且免疫原性好的gD糖蛋白為研究對象,利用TMHMM Server v.2.0和BepiPred 1.0 server在線軟件預測gD蛋白的跨膜區(qū)及抗原表位富集區(qū),確定了從505 bp-987 bp為gD抗原表位富集區(qū),該片段長483 bp;克隆表達gD抗原表位富集區(qū),制備了重組gD-483蛋白,經(jīng)SDS-PAGE、Western blot分析,gD-483蛋白具有良好的抗原性且為可溶性表達。將其作為包被抗原,建立FHV-1抗體間接ELISA診斷方法。結(jié)果顯示gD-483重組蛋白的最佳包被濃度為2ng/μL,時間為37°C 2 h;待檢血清最佳稀釋度為1:400,作用時間為37°C 45 min;二抗最佳稀釋度為1:8000,作用時間為37°C 45 min;底物最佳顯色時間為37°C 5 min。確定陰陽性血清的臨界值為0.432;與FCV、FPV、FIPV-1、FIPV-2陽性血清均無交叉反應(yīng),具有良好的特異性;組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于10%,重復性良好;FHV-1的陽性血清稀釋至1:3200仍顯示為陽性,敏感性好;與IFA比對試驗符合率92%。利用建立的間接ELISA方法檢測100份貓血清樣品,抗體陽性率為77%。本研究分離并鑒定了一株國內(nèi)FHV-1 HR-1,對其進行致病性分析,可為貓傳染性鼻氣管炎疫苗的評價提供效力檢驗用強毒;以gD重組蛋白為包被抗原建立的間接ELISA診斷方法,操作簡便,可為FHV-1感染的防控奠定基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

科學院碩士學位論文 第二章 FHV-1分離鑒定及致-1 毒株感染動物后，在感染六天麻醉動物并處死。取材部位為三叉神經(jīng)節(jié)、肺臟氣管，同時取對照組動物相同的組織。取材的動物組織除三叉神經(jīng)節(jié)外各樣品分液氮速凍后置于-80 °C 保存，待提取組織核酸，進行熒光定量檢測，另一份置于固定；對因 HR-1 感染死亡的動物，取材部位為三叉神經(jīng)節(jié)，肺臟、氣管、腎臟并做同樣處理，最后將固定的組織樣品送至哈爾濱獸醫(yī)研究所病理切片室進行切進行觀察分析。果病毒分離純化及 TCID50測定采集的拭子樣品處理后接種 CRFK 單層細胞 3 d 后出現(xiàn)明顯的 CPE，可見細胞聚后細胞逐漸脫落（如圖 2.1）。將病毒在 CRFK 細胞中通過蝕斑純化 3 代，將純胞后測定其滴度為 108TCID50/mL。

（如圖 2.1）。將病毒在 CRFK 細胞中通過蝕 108TCID50/mL。A:感染組 CRFK 細胞 B：對照組 CRFK 細圖 2.1 拭子接種 CRFK 細胞Fig 2.1 CRFK cell inoculated with swabs培養(yǎng)物上清進行電鏡負染觀察，病毒粒子外約為 150 nm（見圖 2.2）

M：DL2000 DNA Marker；1：gD；2：陰性對照圖 2.3 gD 基因的 PCR 擴增結(jié)果Fig.2.3 Amplication of gD gene by PCRFK 細胞 48 h 后，以 FHV-1 陽性血清作為一抗，以 結(jié)果顯示，病毒感染的細胞單層中出現(xiàn)特異性綠色染 HR-1 的 CRFK 細胞; B:陰性對照圖 2.4 HR-1 病毒 IFA 鑒定結(jié)果B

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本文編號：2758966