【摘要】：單核巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體中一類重要的免疫細(xì)胞,其發(fā)揮的吞噬細(xì)菌作用在病原菌入侵時(shí)發(fā)揮至關(guān)重要的作用。當(dāng)動(dòng)物的免疫細(xì)胞吞噬病原菌后可以激活多種免疫應(yīng)答,隨后對(duì)侵入的病菌進(jìn)行清除。Toll樣受體(Toll-like receptor)作為一類重要的模式識(shí)別受體,在不同種分子刺激下能夠引發(fā)機(jī)體對(duì)病原體的免疫反應(yīng)。其中TLR4在單核巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)識(shí)別包括沙門氏菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分,激活下游多種信號(hào)通路并引發(fā)吞噬細(xì)菌、炎癥反應(yīng)、氧化殺傷等多種免疫反應(yīng),對(duì)最終在動(dòng)物機(jī)體清除病菌中發(fā)揮著重要的作用。動(dòng)物單核巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬病原菌是細(xì)胞發(fā)揮其天然免疫反應(yīng)的首要過(guò)程,而TLR4恰好是識(shí)別這些革蘭氏陰性菌的最重要受體。Southern blot檢測(cè)目前被認(rèn)為是權(quán)威的鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。實(shí)驗(yàn)中首先采用地高辛標(biāo)記探針、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的Southern雜交技術(shù),通過(guò)提取優(yōu)質(zhì)的基因組DNA,嚴(yán)格控制酶切條件、純化探針、優(yōu)化轉(zhuǎn)膜及化學(xué)發(fā)光步驟等過(guò)程獲得信號(hào)強(qiáng)、背景低、重復(fù)性好的Southern雜交結(jié)果。此外轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性綿羊TLR4基因在mRNA水平及蛋白水平均得到了穩(wěn)定高表達(dá)。過(guò)表達(dá)TLR4轉(zhuǎn)基因綿羊單核巨噬細(xì)胞在TLR4配體LPS刺激下,其下游絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶信號(hào)通路(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)在半小時(shí)內(nèi)被迅速地強(qiáng)烈激活,同時(shí)與吞噬細(xì)菌密切相關(guān)的清道夫受體(scavenger receptors,SRs)表達(dá)量顯著升高。首先,通過(guò)對(duì)綿羊單核巨噬細(xì)胞感染沙門氏菌后,轉(zhuǎn)基因綿羊組(transgenic group,Tg)TLR4下游信號(hào)通路中吞噬相關(guān)基因mRNA水平(SR-A,CD36,Lox-1等)和蛋白磷酸化水平(p38,JNK,ERK,Akt)均顯著高于非轉(zhuǎn)基因綿羊組(non-transgenic,NTg)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Tg組細(xì)胞吞噬、黏附細(xì)菌能力均顯著高于NTg組,同時(shí)參與細(xì)胞骨架變化運(yùn)動(dòng)的F-actin含量在30min時(shí)也顯著高于NTg組。隨后,通過(guò)siRNA干擾技術(shù)及添加TLR4特異抑制劑CLI-095后發(fā)現(xiàn),在抑制了 TLR4及TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后,轉(zhuǎn)基因羊單核巨噬細(xì)胞的吞噬黏附細(xì)菌能力顯著降低。最后,為了進(jìn)一步研究在綿羊單核巨噬細(xì)胞中依賴TLR4發(fā)生的吞噬細(xì)菌作用是由何種信號(hào)通路介導(dǎo)的,本研究中分別使用p38,JNK,ERK,PI3K特異性抑制劑抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。最后發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路及PI3K信號(hào)通路都參與到TLR4介導(dǎo)的吞噬細(xì)菌過(guò)程中。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在綿羊單核巨噬細(xì)胞中TLR4通過(guò)影響MAPK、PI3K信號(hào)通路以及隨后激活的F-actin和清道夫受體調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬細(xì)菌功能。并發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TLR4轉(zhuǎn)基因綿羊的單核巨噬細(xì)胞對(duì)沙門氏菌有更強(qiáng)的吞噬能力。本研究豐富了人們對(duì)綿羊中TLR4與吞噬細(xì)菌機(jī)制間聯(lián)系的認(rèn)知,同時(shí)為轉(zhuǎn)基因抗病育種提供了重要的理論依據(jù)及全新的探索。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

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１邋＃逡逑圖１－１．邋Ｔｏｌｌ樣受體在巨噬細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［２４］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋ＴＬＲ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ逡逑１．２．１．１邋ＭｙＤ８８依賴信號(hào)通路逡逑在ＴＬＲ的參與下，ＭｙＤ８８與白介素受體相關(guān)激酶（ＩＲＡＫ）形成復(fù)合物Ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ邋［２５］？逡逑在Ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ形成過(guò)程中，ＩＲＡＫ４激活ＩＲＡＫＩ，并在幾個(gè)位點(diǎn)［２６］進(jìn)行自發(fā)發(fā)生a愃嶧笫頭佩義希停模福稿澹郟玻罰蕁＃桑遙粒耍捎耄裕遙粒疲督岷�，随着Ｔ＿b粒疲隊(duì)敕核亓用福眨攏茫保澈停眨牛鄭粒保兩岷洗俳義希耍叮沉擁模裕遙粒疲逗停裕粒耍鋇鞍準(zhǔn)っ父春銜鋃嗑鄯核鼗＃裕粒耍筆譴俜至言罨鞍準(zhǔn)っ訃っ訃ゅ義廈福ǎ停粒校耍耍耍┘易逯械囊輝�，可以和碟X諮腔裕粒隆劍裕粒攏玻裕粒攏承緯篩春銜錚郟玻�，邋２９ＪnＫ溴義先唬裕粒耍蚣せ畹牡幕粕脅磺宄

本文編號(hào)：2752345