【摘要】：豬流感是豬較為常見(jiàn)的呼吸道疾病,會(huì)引發(fā)咳嗽、打噴嚏、流鼻涕、發(fā)熱和呼吸困難等癥狀。豬流感不但給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的損失,同時(shí)也嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康,因此具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究從某發(fā)病豬場(chǎng)分離到一株H1N1亞型豬流感病毒,進(jìn)一步分析顯示,此病毒屬于歐亞類(lèi)禽豬流感病毒。利用RT-PCR技術(shù),分別擴(kuò)增到8個(gè)基因片段,克隆到流感病毒反向遺傳系統(tǒng)載體上,將8個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,成功拯救了一株豬流感病毒。經(jīng)測(cè)序顯示,拯救得到豬流感病毒與親本毒序列完全一致。比對(duì)序列發(fā)現(xiàn),PB2基因存在兩個(gè)啟動(dòng)子,多編碼一個(gè)長(zhǎng)度為71個(gè)氨基酸的蛋白,命名為PB2-X。通過(guò)定點(diǎn)突變的方法突變掉PB2基因多余的啟動(dòng)子(ATG-ATT),拯救出一株不表達(dá)PB2-X的突變毒株。通過(guò)分別在MDCK細(xì)胞與ST細(xì)胞上比較兩株病毒的生長(zhǎng)特性,結(jié)果顯示兩株病毒在ST細(xì)胞中復(fù)制能力均較強(qiáng)。通過(guò)生長(zhǎng)曲線測(cè)定、聚合酶活性試驗(yàn)等試驗(yàn)證明了不表達(dá)PB2-X蛋白的突變毒株的復(fù)制能力優(yōu)于原毒株。說(shuō)明PB2-X蛋白的存在影響了病毒的體外復(fù)制能力。通過(guò)小鼠攻毒試驗(yàn)比較兩株病毒的致病力,結(jié)果顯示兩組接毒小鼠的體重沒(méi)有明顯的降低,說(shuō)明分離的歐亞類(lèi)禽H1N1豬流感病毒對(duì)小鼠的致病性較弱,PB2-X對(duì)其致病性影響較小。本研究建立的歐亞類(lèi)禽豬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)為研究其復(fù)制與致病機(jī)制奠定基礎(chǔ),并首次發(fā)現(xiàn)此歐亞類(lèi)禽H1N1豬流感病毒PB2基因表達(dá)一個(gè)新的PB2-X蛋白。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.651
【圖文】：

低于 5%[4]。一旦繼發(fā)感染了其他病毒養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)，這是巨大災(zāi)難[5-6]。因?yàn)樨i兼有人在同時(shí)感染豬的時(shí)候會(huì)在豬體內(nèi)發(fā)生基因重組8]。因此，SI 具有很重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義和傳遍及全球，呈全球流行的趨勢(shì)，也成為了對(duì)豬生安全帶來(lái)巨大威脅，所以應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)于豬流究。但由于豬流感病毒是RNA病毒，不容易對(duì)其學(xué)對(duì)基因組的操作提供了很大的便利[11]。子生物學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)下觀察病毒，其形狀可以為圓形或絲狀，其直的纖突為 HA、NA、M2 組成的膜蛋白，其中凝活性并凝集雞紅細(xì)胞。內(nèi)部結(jié)構(gòu)為核衣殼[12]

形狀較小，對(duì)照組并沒(méi)有出現(xiàn)空斑，根據(jù)以上病毒�；驍U(kuò)增與質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果毒通用引物對(duì)病毒 cDNA 進(jìn)行 PCR 時(shí)，能夠直接將所有 PCR 結(jié)果如下圖所示。將反向遺傳質(zhì)粒 pLLB 載體進(jìn)行圖如下：1、2、3 道為酶切后的載體，第四道為原質(zhì)粒，所以條帶在線性化質(zhì)粒的下方，這樣就確定 1、2、3與片段連接。將擴(kuò)增的 8 個(gè)基因片段分別與 pLLB 載體R 鑒定，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌液送至測(cè)序公司測(cè)序，得到測(cè)進(jìn)行 BLAST，結(jié)果顯示 8 個(gè)片段均來(lái)源于歐亞類(lèi)禽豬流，保存陽(yáng)性菌液，質(zhì)粒提取后測(cè)定的濃度和 OD 值均正病毒拯救試驗(yàn)。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌液送至測(cè)序公司測(cè)序，得到測(cè)，進(jìn)行 BLAST，結(jié)果顯示 8 個(gè)片段均來(lái)源于歐亞類(lèi)禽豬流感功，保存陽(yáng)性菌液，質(zhì)粒提取后測(cè)定的濃度和 OD 值均正確行病毒拯救試驗(yàn)。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 132、3 為 NP，4、5、6 為 PA、7 為 Marker，8、9、10 為 PB1，11、12、13 為 P圖 2 各基因的 PCR 結(jié)果Fig.2 The PCR result of gene1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 徐匯洋;許榜豐;陳艷;隋金鈺;楊煥良;尹航;楊大為;喬傳玲;陳化蘭;;一株H1N1豬流感病毒的進(jìn)化分析與分子特征[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年15期

2 高淑霞;王文志;張召坤;張偉;;豬流感的監(jiān)測(cè)及其公共衛(wèi)生意義[J];畜牧與飼料科學(xué);2010年05期

3 劉大飛;劉明;劉春國(guó);楊濤;萬(wàn)春和;陳浩;齊金龍;杜金玲;李洪濤;孫恩成;劉大程;;H1N1亞型豬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及高產(chǎn)細(xì)胞型疫苗株的拯救[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年05期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 陳瑩瑩;重組蝙蝠流感病毒的生物學(xué)特性的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

2 任娟娟;陜西省H1N1豬流感病毒的分離鑒定及全基因序列分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2751879