【摘要】：色素沉積包括黑色素細胞產(chǎn)生黑色素和黑色素轉(zhuǎn)運到周圍角質(zhì)形成細胞這兩個過程。色素沉積過程復(fù)雜,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個基因和microRNAs調(diào)控該過程。前期對不同毛色羊駝皮膚microRNAs的表達譜分析發(fā)現(xiàn)microRNA-5110呈差異表達,可能與毛色形成相關(guān)。本研究通過生物信息學分析,靶基因驗證,microRNA-5110調(diào)控黑色素生成和轉(zhuǎn)運的研究,運用雙熒光報告試驗,熒光定量PCR試驗,蛋白免疫印跡試驗,組織免疫化學與細胞免疫化學試驗,原位雜交試驗及深度測序試驗,揭示microRNA-5110在黑色素沉積機制的調(diào)控作用。試驗內(nèi)容和結(jié)果如下:1.運用miRBase和TargetScan靶基因生物信息學分析發(fā)現(xiàn)microRNA-5110的靶向基因有Wnt1和MLPH,經(jīng)靶基因3'-UTR雙熒光報告載體和microRNA-5110過表達載體在293T細胞中共表達后,雙熒光素的活性分別為對照組的0.53倍和0.42倍。因此,推測Wnt1和MLPH為microRNA-5110的兩個靶向基因。2.在羊駝黑色素細胞中,轉(zhuǎn)染microRNA-5110后,經(jīng)real-time PCR和western blotting方法檢測microRNA-5110轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細胞后靶基因Wnt1、MLPH,主要色素調(diào)控基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2,與黑色素顆粒轉(zhuǎn)運相關(guān)基因Rab27a、Myosin Va的mRNA,蛋白水平以及黑色素含量的變化。實驗結(jié)果顯示,microRNA-5110過表達下調(diào) Wnt1、MLPH、MITF、TYR、TYRP1、Rab27a 和 Myosin Va 基因 mRNA 表達,而上調(diào) TYRP2mRNA 表達;microRNA-5110 過表達下調(diào) Wnt1、MLPH、MITF、TYR、TYRP1、Rab27a和Myosin Va蛋白水平,但是TYRP-2蛋白水平相對上調(diào);microRNA-5110過表達引起總黑色素含量和褐黑素含量明顯下調(diào),真黑色素含量明顯上調(diào)。因此,推測microRNA-5110參與黑色素形成和轉(zhuǎn)運的調(diào)控。3.建立microRNA-5110轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)的黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞后,Fontana-Masson染色發(fā)現(xiàn)黑色素細胞和角質(zhì)形成細胞內(nèi)黑色素顆粒明顯減少;皮下注射microRNA-5110過表達載體后,小鼠毛色表型變淺。microRNA-5110轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中MITF、TYR、TYRP1、Rab27a 和 MyosinVa 基因 mRNA 表達低于正常組小鼠,TYRP2 mRNA高于對照組:microRNA-5110轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白水平低于對照組,microRNA-5110轉(zhuǎn)基因小鼠總黑色素和褐黑色素含量明顯低于對照組,而真黑色素含量明顯高于對照組。因此,推測microRNA-5110參與動物毛色形成和轉(zhuǎn)運的調(diào)控。4.為了盡可能的發(fā)現(xiàn)黑色素顆粒合成和轉(zhuǎn)運機制,對過表達microRNA-5110的黑色素細胞進行了深度測序。結(jié)果顯示:四個分子路徑即黑素原生成途徑,MAPK途徑,Wnt信號途徑和cAMP信號途徑表達差異。其中有48個為上調(diào)基因,212個基因為下調(diào)基因。熒光定量分析 DKK1,gp10O,IGF1R,CDK5,Ednrb,Kitl,Myc 和 sGC 的 mRNA表達差異及MAPK信號通路mRNA表達差異,其結(jié)果與RNA測序結(jié)果相一致。5.運用real time PCR,western blotting及組織免疫化學實驗,檢測cAMP信號途徑中鳥氨酸環(huán)化酶(sGC)在白色與黑色綿羊皮膚中的表達差異。結(jié)果顯示,sGC mRNA和蛋白在黑色綿羊皮膚中的表達量顯著低于白色綿羊皮膚;組織免疫化學結(jié)果顯示:在白色綿羊皮膚中sGC陽性反應(yīng)分布在毛乳頭上方;在黑色綿羊皮膚中sGC陽性反應(yīng)分布在毛乳頭及外根鞘。pGLO-sGC轉(zhuǎn)染綿羊黑色素細胞后,MITF,TYR,TYRP1和TYRP2的mRNA和蛋白相對表達量下調(diào)。結(jié)論:microRNA-5110通過靶向結(jié)合Wnt1和MLPH調(diào)控毛色基因MITF,TYR,TYRP1和TYRP2以及轉(zhuǎn)運基因MyosinVa和Rab27a的表達而影響小鼠毛色表型變化。microRNA-5110在黑色素細胞中參與多條信號路徑,其中sGC是潛在的被調(diào)控基因之一,在黑色素細胞中受microRNA-5110的調(diào)控。
【學位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S813.1
【圖文】：

１黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞逡逑表皮內(nèi)的黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞以接近１：１０的比例存在并進行黑色素顆粒的逡逑分配（圖１－１）。在ＪＨ常情況下，位于表皮基底層的黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞是一個增殖逡逑及其緩慢的穩(wěn)定種群，但是表皮上層的角質(zhì)形成細胞的增殖是相對迅速的。向上的壓力逡逑將角質(zhì)形成細胞連同角質(zhì)形成細胞攝入的黑色素顆粒推向皮膚的表面形成－種臨界屏逡逑障，從而使有機體抵御來自環(huán)境的ＩＥ力。因此，不僅是黑色素細胞內(nèi)的黑色素顆粒，還逡逑有與位于淺表層的角質(zhì)形成細胞的相互作用，從而賦予了皮膚特征性顏色。盡管在身體逡逑不同位置的黑色素細胞（比如毛囊、眼睛、內(nèi)耳等）與周圍細胞的相互作用方式不同于表逡逑皮方式，但是參與產(chǎn)生黑色素顆粒所涉及的基本過程和合成黑色素顆粒的細胞器（稱為逡逑黑素體）是相似的。逡逑ｌ邋＊邋＾邋＼邐＼邐９逡逑圖１－１黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞模式圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ邋ａｎｄ邋ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ逡逑－３－逡逑

虻牡鞍姿釘夥從κ頭牛危錚簦悖璧幕钚園閬誚峁褂潁]3?（ＮＩＣ），其隨后易位到細胞核內(nèi)與ＲＢＰ－Ｊ轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生反式激活復(fù)合物所得的轉(zhuǎn)錄逡逑激活復(fù)合物促進各種靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括Ｈｅｓ基因的成員和Ｈｅｙ基因家族（圖１－４）。這逡逑些核內(nèi)蛋白質(zhì)對系譜特定性基因的表達具有反作用，比如Ａｓｃｉｉ，邋ＭｙｏＤ，邋Ａｔｏｈｌ和Ｅ２Ａ，逡逑從而維持細胞的未分化狀態(tài)ｔ１４＃。逡逑ｌｂ邐罐一逡逑Ｉ邐ｔ－ｅ＾ｃＥ逡逑§邐ｖ－ｓ？ｃｒ＾ａｓ８逡逑（ｈｋ）ｔｃｈ邐１邋Ｇ0Ｊ0？邋少逡逑ＣＺ２ＨＺＤ逡逑ＣｙｔＣＨ＾ｍ逡逑■佊．邋ｉ聯(lián)腿灥Ｅ壚ｆｆｉ

本文編號：2750767