【摘要】：奶牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis,TB)和布魯氏菌病(Bovine brucellosis)嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展和人類公共衛(wèi)生安全。2012年,國務(wù)院辦公廳印發(fā)了《國家動(dòng)物疫病防治中長期規(guī)劃(2012-2020)》,將奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病列為二類動(dòng)物疫病,且制定了奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病的綜合防治措施。本研究根據(jù)《2017年國家動(dòng)物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》(農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]7號(hào))、《全國動(dòng)物疫病專項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查實(shí)施方案》(農(nóng)醫(yī)防便函[2016]322號(hào))、《國家奶牛結(jié)核病防治指導(dǎo)意見(2017-2020)》(農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]20號(hào))和《國家布魯氏菌病防治計(jì)劃(2016-2020)》(農(nóng)醫(yī)發(fā)[2016]38號(hào))規(guī)定的奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病調(diào)查方案,對貴州地區(qū)奶牛結(jié)核病和布魯氏桿菌病感染情況展開調(diào)查,初步掌握了貴州省奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病感染情況;并建立快速、準(zhǔn)確、可靠的牛結(jié)核病和布魯氏菌病的二重PCR診斷方法;通過對牛奶營養(yǎng)安全和衛(wèi)生安全的研究分析,并參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定,確定了安全評(píng)價(jià)體系的檢測項(xiàng)目及指標(biāo),并建立可實(shí)施的安全性評(píng)價(jià)體系。以期為貴州省奶牛養(yǎng)殖,牛奶安全保障提供參考。1貴州省奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病感染情況調(diào)查為了解貴州省奶牛結(jié)核病的感染流行情況,2017-2018年間試驗(yàn)隨機(jī)抽取貴州省9個(gè)州市的規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場共106場次,兩年間采集抗凝血液樣品20 478份進(jìn)行牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)檢測,檢出陽性樣品10份,個(gè)體陽性率為0.05%(10/20 478),其中2017年檢出陽性樣品7份,個(gè)體陽性率為0.07%(7/10 306),2018年檢出陽性樣品3份,個(gè)體陽性率0.03%(3/10 172)。可見,2018年較2017年陽性率有所下降;為調(diào)查布魯氏菌病感染情況,2017-2018年間試驗(yàn)隨機(jī)采集了全省9個(gè)州市的共106場次的奶牛全血樣品27 435份,其中檢出陽性樣品6份,陽性率為0.02%(6/27 435),2017-2018年同一個(gè)場群連續(xù)檢出陽性,2017年陽性群體為4個(gè),2018年下降到了2個(gè)。調(diào)查結(jié)果表明,近年來貴州省關(guān)于奶牛結(jié)核病和布病的防控防疫措施收到一定成效,兩種傳染病的感染率呈下降趨勢。2奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病二重PCR診斷方法的建立及應(yīng)用參照NCBI中牛結(jié)核分枝桿菌pnc A(AF212297))、布魯氏桿菌BM 21(AL27674)等基因序列,應(yīng)用相關(guān)軟件各設(shè)計(jì)了1對特異性引物,分別用于擴(kuò)增牛結(jié)核分枝桿菌pnc A基因、布魯氏桿菌BM 21基因的部分序列,擴(kuò)增的目的片段大小為416 bp和282bp。用合作單位提供的陽性病料,通過對2種細(xì)菌單一PCR的退火溫度和敏感性進(jìn)行優(yōu)化和檢測,得到最佳退火溫度分別為:牛結(jié)核分枝桿菌57℃、布魯氏桿菌59℃,由敏感性得出最低檢測量分別是:牛結(jié)核分枝桿菌68 pg、布魯氏桿菌43 pg。再選擇合適的二重PCR緩沖體系及酶,優(yōu)化退火溫度、模板及引物濃度,得出最佳反應(yīng)體系為25μL,最佳退火溫度為59℃;最后摸索二重PCR的特異性、敏感性,結(jié)果二重PCR中兩種細(xì)菌的最低檢測量分別為牛結(jié)核分枝桿菌68 pg、布魯氏桿菌43 pg,證明試驗(yàn)建立的二重PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),本試驗(yàn)成功建立了一種能夠同時(shí)且快速檢測牛結(jié)核病和布魯氏桿菌病的二重PCR檢測方法。應(yīng)用所建立的牛結(jié)核病和布魯氏菌病二重PCR檢測方法對2017-2019年4月間貴州部分地區(qū)的246份病料進(jìn)行檢測,二重PCR檢測結(jié)果表明:246份病料中檢出牛結(jié)核陽性1份,感染率為0.4%(1/246);檢出布病陽性2份,感染率為0.81%(2/246);牛結(jié)核和布魯氏菌病混合感染1份,混合感染率為0.4%(1/246);二重PCR與單一PCR的符合率均為100%。由此可見,奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病在貴州省牛群中存在且有混合感染的情況,試驗(yàn)建立的二重PCR檢測方法對奶牛場單一或混合感染的快速診斷具有十分重要的意義。3牛奶安全性評(píng)價(jià)體系的建立及推廣應(yīng)用為確保牛奶的安全,本試驗(yàn)通過對貴州省奶牛養(yǎng)殖情況的調(diào)查,牛奶營養(yǎng)安全和衛(wèi)生安全的分析及探討,確定了本實(shí)驗(yàn)安全性評(píng)價(jià)體系需檢測牛奶中是否含有牛結(jié)核分枝桿菌、布魯氏桿菌;牛奶乳蛋白含量是否達(dá)標(biāo);鉛、汞、磺胺類、氯霉素、三聚氰胺、黃曲霉素的含量是否超標(biāo)。并參照國家和國際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定,確定安全性評(píng)價(jià)體系所測項(xiàng)目的指標(biāo)為:不得檢出牛結(jié)核分枝桿菌和布魯氏桿菌;不得檢出氯霉素和三聚氰胺;乳蛋白含量不得低于2.8 g/100 g、鉛含量不得高于0.05 mg/kg、汞含量不得高于0.01mg/kg、磺胺類殘留不得超過0.10 mg/kg、黃曲霉素M1不得超過0.5 ug/kg,并建立可實(shí)施的評(píng)價(jià)體系。該方案首先采用本實(shí)驗(yàn)已建立的二重PCR檢測方法檢測牛結(jié)核和布病,再進(jìn)行后續(xù)項(xiàng)目檢測。為驗(yàn)證方案的可行性和實(shí)用性,本實(shí)驗(yàn)于2017-2019年4月間,從貴州省不同養(yǎng)殖場采集牛奶樣品共2 123份,進(jìn)行牛結(jié)核病和布病以及重金屬鉛、汞含量、磺胺類殘留、三聚氰胺、黃曲霉素M1、氯霉素含量等檢測,未檢出鉛、氯霉素、三聚氰胺不合格奶樣,檢出牛結(jié)核和布病不合格樣品4份,乳蛋白含量不合格17份、磺胺類含量超標(biāo)26份,黃曲霉素M1超標(biāo)11份,將檢測數(shù)據(jù)加以統(tǒng)計(jì)分析,得出針對貴州牛奶安全的建議指標(biāo)。結(jié)果表明該安全性評(píng)價(jià)方案可以推廣實(shí)施。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23
【圖文】：

圖 2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)Figure 2.1 Tiger red plate agglutination testSAT) 1:50、1:100、1:200、1:400，4 個(gè)稀釋度，釋度，本實(shí)驗(yàn)選用的稀釋度為 1:50 和 1:100釋到 1:50 和 1:100，抗原作 20 稀釋并加入℃溫箱 22-24 h 后，取出檢查并記錄結(jié)果。陽性血清和抗原對照:、陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血釋到原有滴度，家抗原的方法與受檢血清相

圖 3.1 樣品來源及采集Figure 3.1 Sample Source and AcquisitionEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver19-T Vector等均購自大連寶生物工程有限公司（ Kit 試劑盒和E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit 質(zhì)iowest 公司產(chǎn)品；乙醇等為國產(chǎn)分析純試劑。器與耗材儀、Thermo Forma -80℃超低溫冰箱和 Gel DOC公司；

NA模板 4.0 μLTaq酶 1.0 μL體積 25.0 μL應(yīng)條件的優(yōu)化應(yīng)的退火溫度（55-60℃）進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳最佳反應(yīng)條件為:枝桿菌最佳反應(yīng)條件:in；94℃ 45 s，57.0℃ 45 s，72℃ 60 s，35cycle見圖 3.2。菌最佳反應(yīng)條件:min；94℃ 30s，59.0℃ 30 s，72℃ 60 s，35cycl見圖 3.3。

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本文編號(hào)：2747628