【摘要】：骨骼肌作為一類橫紋肌,是生物體中最重要的運動器官,而畜禽的骨骼肌不僅可以作為重要的運動器官,還是人類攝取優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源之一,因此對畜禽骨骼肌發(fā)育的研究就顯得尤為重要。衛(wèi)星細胞作為動物骨骼肌的祖細胞,是一類未分化的單核細胞,定位于肌纖維基膜和肌細胞膜之間的間隙,緊緊粘附于肌纖維。衛(wèi)星細胞可以參與肌纖維的發(fā)育并為其所附著的肌纖維提供細胞核。動物出生后骨骼肌中的衛(wèi)星細胞會逐漸轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài)。當肌纖維受損時,衛(wèi)星細胞可以被激活并開始進行不對稱分裂,一部分子細胞進入細胞循環(huán)開始大量增殖并進行肌源性分化,參與肌纖維的再生;另一部分子細胞則退出細胞循環(huán)轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài),進行自我更新,從而維持處于靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細胞數(shù)目的穩(wěn)定,因此衛(wèi)星細胞具有干細胞的特性,是一種肌源性的祖細胞。本研究用C57/BL6小鼠為模型,在細胞水平和組織水平探討骨骼肌發(fā)育過程中衛(wèi)星細胞的分化能力以及調(diào)控機制,并對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的發(fā)育規(guī)律進行了初步研究。取得了以下結(jié)果:(1)哺乳動物出生后骨骼肌中PAX7~+細胞數(shù)目逐漸減少。本研究選取出生后1天、8天、2周、4周、6周、8周、10周、12周、24周以及52周共10個時間點的小鼠的腓腸肌進行組織切片免疫熒光檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PAX7~+細胞數(shù)目在小鼠出生后1天時約為19.7%,但隨著年齡的增長顯著下降,在大于10周齡的小鼠中PAX7~+細胞數(shù)目的比率則穩(wěn)定在0.5%以下。(2)出生后小鼠衛(wèi)星細胞中MYF5、MYOD以及myogenin的表達模式。本研究對不同年齡小鼠腓腸肌進行組織切片免疫熒光檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MYF5~+細胞數(shù)目在小鼠出生1天到8周齡雖然有輕微的下降,但總體維持在較高水平,而在10周齡后則顯著下降。MYOD~+細胞數(shù)目在小鼠出生后不同的年齡段均維持在一個較低的水平。Myogenin~+細胞數(shù)目在小鼠出生后1天到2周顯著下降,但在4周和6周時顯著上升,隨后又顯著下降。(3)骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化能力隨著年齡的增長而下降。本研究選取出生后2周、4周、6周、8周、10周以及12周共6個時間點的小鼠腿肌用于衛(wèi)星細胞的分離和培養(yǎng),然后利用免疫熒光和Q-PCR實驗檢測衛(wèi)星細胞的分化能力。免疫熒光和Q-PCR結(jié)果表明,骨骼肌衛(wèi)星細胞被誘導分化24 h和48 h后,分化標志基因Mck和肌漿球蛋白(myosin)的表達水平隨著小鼠年齡的增長而呈現(xiàn)逐漸下調(diào)的趨勢。(4)不同時期衛(wèi)星細胞的差異表達基因鑒定。本研究分離了2周、4周、6周、8周、10周以及12周六個時間點的小鼠腿肌衛(wèi)星細胞,并對其進行轉(zhuǎn)錄組分析。通過基因差異表達分析,本研究共得到了2907個DEGs。WGCNA分析發(fā)現(xiàn),這2907個DEGs可以被富集到6個主要的表達模塊,其中有1739個基因被富集到紅色模塊,且紅色模塊中的基因多與骨骼肌的發(fā)育過程相關(guān)(p0.01)。Pathway分析表明這1739個差異基因主要富集到12個信號通路(p0.01),包括細胞粘附,肥厚型心肌病,Wnt以及MAPK等。綜合Q-PCR驗證分析和共表達網(wǎng)絡(luò)分析,本研究篩選出三個關(guān)鍵基因,即Tgfβ2、Wnt9a和Fgfr4。(5)TGFβ2、TGFβ3以及WNT9a可以有效地抑制衛(wèi)星細胞的分化。在細胞水平,衛(wèi)星細胞分化時期Tgfβ2、Tgfβ3、Wnt9a、Akt2和Mknk2的表達水平與增殖期相比顯著上調(diào);利用si-RNA或Pirfenidone抑制TGFβ2、TGFβ3和WNT9a可以顯著促進肌管的形成和MyHC2d以及Mck基因的表達。在組織水平,利用Pirfenidone抑制小鼠體內(nèi)TGFβ2蛋白的表達可以有效地促進衛(wèi)星細胞的激活和分化,從而促使衛(wèi)星細胞與肌管融合以及骨骼肌的再生。(6)FGFR4可以有效地促進衛(wèi)星細胞的分化。在衛(wèi)星細胞分化時期Fgfr4基因的表達與增殖期相比顯著上調(diào)。在衛(wèi)星細胞中抑制FGFR4蛋白表達可以顯著抑制肌管的形成和分化marker基因MyHC2d以及Mck的表達。(7)TGFβ2、FGFR4以及WNT9a通過影響衛(wèi)星細胞的激活狀態(tài)來調(diào)控骨骼肌的發(fā)育。本研究利用si-RNA抑制衛(wèi)星細胞中TGFβ2、TGFβ3、FGFR4和WNT9a蛋白的表達,或利用Pirfenidone抑制細胞水平和組織水平TGFβ2的表達。Western blotting結(jié)果表明,TGFβ2、TGFβ3和WNT9a可以促進PAX7的表達,抑制MYOD的表達;FGFR4可以抑制PAX7的表達,促進MYOD的表達。(8)TGFβ2,FGFR4和WNT9a蛋白之間具有相互調(diào)節(jié)作用。Western blotting結(jié)果表明,TGFβ2可以抑制FGFR4、WNT9a、AKT2和MKNK2蛋白的表達;FGFR4可以抑制TGFβ2和WNT9a的表達,促進AKT2和MKNK2蛋白的表達;而WNT9a可以促進TGFβ2和FGFR4的表達,但是對AKT2和MKNK2蛋白水平的影響不顯著。(9)對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的初步研究。本研究選取大白豬胚胎35天、胚胎55天、出生1天、1月齡、2月齡、3月齡、6月齡以及12月齡共八個時間點的背最長肌進行免疫熒光檢測。結(jié)果表明,MYF5~+細胞數(shù)目隨著骨骼肌的發(fā)育逐漸減少;MYOD~+細胞數(shù)目在胚胎期55天最高,但是在其它時期均較低;myogenin~+細胞數(shù)目從胚胎期到出生后逐漸下降。本研究通過對分離培養(yǎng)的衛(wèi)星細胞進行誘導分化發(fā)現(xiàn),MYOD和myogenin作為分化早期marker,在細胞分化啟動時表達上調(diào),隨后又顯著下調(diào)。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.2
【圖文】：

Fig. 1. Muscle structure and the location of satellite cell.骨骼肌衛(wèi)星細胞的來源骼肌衛(wèi)星細胞的首次發(fā)現(xiàn)是在 1961 年。Mauro 在利用電鏡觀察青蛙骨骼肌現(xiàn)了一類與肌纖維緊密粘附的單核細胞。這些細胞在肌纖維表面形成突起肌纖維膜和肌纖維基膜之間的空隙，并且細胞膜與基膜和肌纖維膜接觸但類細胞因其與肌纖維的位置關(guān)系而被 Mauro 命名為衛(wèi)星細胞（Mauro 196星細胞發(fā)現(xiàn)以來，其在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮的作用越來越受到人們重視祖細胞的發(fā)育分為胚胎期和出生后兩個階段，胚胎期的細胞稱為骨骼肌前而出生后則稱為衛(wèi)星細胞。Pax3 和 Pax7 是骨骼肌祖細胞的 marker 基因，的發(fā)育以及衛(wèi)星細胞特性的維持等方面具有重要的作用。研究表明，體節(jié)來源于軸旁中胚層和中胚層背側(cè)，而體節(jié)背側(cè)可以發(fā)育成骼肌組織，因此被稱為生皮肌節(jié)（Christ and Ordahl 1995, Daughters et al. 20

圖 3. 衛(wèi)星細胞異質(zhì)性分裂示意圖Fig 3. Schematic diagram of asymmetric division of satellite cells很多研究都表明了肌纖維的再生能力取決于衛(wèi)星細胞的增殖和分化能力以及自新能力。Collins 等人將新鮮完整的肌纖維移植到肌營養(yǎng)不良的小鼠骨骼肌部位發(fā)現(xiàn)供體小鼠的肌纖維移植后，肌纖維表面的衛(wèi)星細胞被激活并且開始大量增然后進行肌源性分化形成新的肌纖維從而補充受體小鼠肌纖維的不足（Collins 005）。而在小鼠骨骼肌中特異消融 PAX7 陽性的衛(wèi)星細胞，骨骼肌纖維的再生能顯著抑制（Lepper et al. 2011）。Lepper 等人利用細胞標記追蹤技術(shù)研究了 PAX星細胞參與的骨骼肌再生過程中的作用。Christoph Lepper 用 β-gal 標記 PAX的衛(wèi)星細胞，并利用 CTX 對肌纖維進行損傷，研究發(fā)現(xiàn)在肌纖維再生的過程中的肌纖維均為 β-gal 陽性，表明 PAX7 陽性細胞是骨骼肌再生過程中主要的細胞（Lepper et al. 2009）。Guitart 等人研究了在小鼠骨骼肌損傷過程中衛(wèi)星細胞的，發(fā)現(xiàn)在受損傷的骨骼肌中增殖狀態(tài)的 PAX7+衛(wèi)星細胞顯著增加，并且通過電

17圖 4.本研究的技術(shù)路線Fig 4 The scheme of this study2.2 實驗動物本實驗所用到的 C57/BL6 雌性小鼠（SPF 級）購自湖北省疾病預(yù)防控制中心。其中組織樣本來源于 10 個不同年齡的小鼠，即出生后 2 天（2 d）、8 天（8 d）、2 周（2 w）、4 周（4 w）、6 周（6 w）、8 周（8 w）、10 周（10 w）、12 周（12 w）、24周（24 w）以及 52 周（52 w）。我們從每個年齡段的小鼠的腿肌取三份組織樣品：兩份（全部腿肌組織樣）用液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù) Q-PCR和 Western blotting 的研究；一份（腓腸肌組織樣）保存在 4%多聚甲醛緩沖固定液中，用于免疫組織化學的研究。本實驗用于分離衛(wèi)星細胞的小鼠腿肌樣本來源于 6個不同年齡的小鼠，即出生后 2 周（（2 w）、4 周（4 w）、6 周（6 w）、8 周（8 w）、

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黃子瑩;李龍;李倩倩;劉向東;李長春;;lncRNA TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響[J];遺傳;2019年12期

2 黃何平;徐爽;肖桃芳;雷筱鋒;;骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌纖維病變的影響[J];中國組織工程研究;2018年04期

3 吳]};陸耀飛;;骨骼肌衛(wèi)星細胞研究進展[J];健康研究;2009年05期

4 董少紅;張鵬;溫雋珉;高虹;龐新利;;酸性成纖維細胞生長因子促進兔骨骼肌衛(wèi)星細胞生長的研究[J];中華醫(yī)學雜志;2007年17期

5 陳從波;姚啟盛;王衛(wèi)民;王曉康;陳立新;;骨骼肌衛(wèi)星細胞純化及培養(yǎng)的實驗研究[J];實用醫(yī)學雜志;2006年07期

6 仝昕煒;;骨骼肌衛(wèi)星細胞的研究進展[J];當代體育科技;2017年04期

7 余群;王麗平;翁錫全;;負荷運動對人體骨骼肌衛(wèi)星細胞的影響[J];安順學院學報;2014年06期

8 柯棠山;董進;廖娟;劉坤祥;;兔骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離、培養(yǎng)及成肌特性[J];遵義醫(yī)學院學報;2015年02期

9 殷紅艷;佟慧麗;劉丹;嚴云勤;;脂肪酸對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響[J];中國民康醫(yī)學;2015年14期

10 陳濤;王海燕;陳彩珍;盧健;;機械牽拉誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞激活的分子機制研究進展[J];中國運動醫(yī)學雜志;2011年10期

相關(guān)會議論文 前10條

1 吳]};陸耀飛;;不同氧環(huán)境及葡萄糖濃度對體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞的影響研究[A];第九屆全國體育科學大會論文摘要匯編(4)[C];2011年

2 楊少光;房佰俊;史明霞;曹德俊;劉杰文;趙春華;;胚胎骨骼肌衛(wèi)星細胞多向性特征[A];第九屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2003年

3 申傳安;柴家科;;骨骼肌衛(wèi)星細胞的生物學特性[A];全國燒傷創(chuàng)面處理、感染專題研討會論文匯編[C];2004年

4 馬書杰;;手法對家兔不同急性損傷骨骼肌衛(wèi)星細胞影響觀察[A];中華中醫(yī)藥學會推拿分會第十四次推拿學術(shù)交流會論文匯編[C];2013年

5 王松波;朱曉彤;束剛;江青艷;;骨骼肌衛(wèi)星細胞及其分子調(diào)控[A];全國動物生理生化第十次學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2008年

6 秦子來;朱衛(wèi)雄;張杰;;多種生長因子聯(lián)合使用對體外培養(yǎng)人骨骼肌衛(wèi)星細胞的作用[A];第八屆全國體育科學大會論文摘要匯編（一）[C];2007年

7 楊玉存;江青艷;朱曉彤;高萍;束剛;高淑靜;傅偉龍;;不同來源的骨骼肌衛(wèi)星細胞IGF-1相關(guān)基因表達的比較[A];動物生理生化學分會第八次學術(shù)會議暨全國反芻動物營養(yǎng)生理生化第三次學術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2004年

8 史仍飛;危小焰;卞玉華;;不同頻率機械牽張刺激對骨骼肌衛(wèi)星細胞Myostatin表達的影響[A];第九屆全國生物力學學術(shù)會議論文匯編[C];2009年

9 張鵬;劉紅菊;李莉;楊明浩;陳曉萍;;Smad3抑制成年骨骼肌衛(wèi)星細胞的成肌分化潛能[A];中國細胞生物學學會第九次會員代表大會暨青年學術(shù)大會論文摘要集[C];2007年

10 薄海;楊爽;張勇;;氧化應(yīng)激通過下調(diào)PGC-1β抑制骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化[A];中國生理學會內(nèi)分泌代謝、比較生理與應(yīng)激生理學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2017年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 王雪飛;骨髓干細胞移植廣泛應(yīng)用尚待時日[N];健康報;2006年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 蘇日娜;不同飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊宰后肉品質(zhì)和骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2019年

2 王f;組蛋白修飾調(diào)控豬骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2019年

3 張維婭;不同年齡骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化能力及調(diào)控機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2018年

4 烏日罕;烏珠穆沁羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)及其分化過程中肌肉與肌內(nèi)脂肪相關(guān)基因的表達變化[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2018年

5 徐清斌;自體干細胞移植治療冠心病的研究[D];南京醫(yī)科大學;2004年

6 邵素霞;大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的原代培養(yǎng)及其移植治療心梗實驗研究[D];河北醫(yī)科大學;2004年

7 李映川;自體骨骼肌衛(wèi)星細胞注射治療女性壓力性尿失禁的實驗研究[D];復(fù)旦大學;2006年

8 薄海;運動促衰老骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化的線粒體重構(gòu)機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2012年

9 張偉偉;miR-2400和EGR1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程中MyoG基因表達調(diào)控[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2015年

10 張偉;綿羊骨骼肌高表達miRNA靶基因的高通量獲取及部分候選靶基因生物功能研究[D];石河子大學;2015年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 鄒玉珍;微波治療對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖能力的影響[D];上海交通大學;2017年

2 王莉曉;經(jīng)典Wnt通路相關(guān)基因在大鼠骨骼肌損傷后骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達研究[D];山西醫(yī)科大學;2019年

3 羅燕柳;Akirin2對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞慢型肌纖維表達的影響及精氨酸的調(diào)控研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2017年

4 屈文萍;長非編碼RNA-AK394747在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖及分化過程中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2018年

5 楊璐;機械牽拉對大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖作用及作用途徑的研究[D];上海體育學院;2018年

6 馮青輝;肉羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)及MRFs基因表達量的分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2017年

7 許詔;新模型致大鼠慢性坐骨神經(jīng)卡壓后骨骼肌衛(wèi)星細胞的變化[D];華中科技大學;2016年

8 泮殷;MGF對骨骼肌衛(wèi)星細胞MEK-ERK信號通路影響的研究[D];上海體育學院;2017年

9 劉月光;利用單根肌纖維法分離和培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細胞及其成肌誘導分化研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2011年

10 龐新利;重組人類酸性成纖維細胞生長因子聯(lián)合自體骨骼肌衛(wèi)星細胞心肌移植[D];暨南大學;2006年

本文編號：2746934