【摘要】：RNAscope原位雜交(RNAscope in situ hybridization,簡稱RNAscope~?)是一種新型原位雜交技術(shù),其原理為堿基互補配對原則,結(jié)合信號級聯(lián)放大技術(shù)和背景抑制策略使得該技術(shù)在實驗室檢測中具有一定優(yōu)勢。本實驗利用RNAscope~?成功檢測到感染動物組織切片中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),并對其特異性進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,該技術(shù)在PRRSV檢測中具有較高特異性。將RNAscope~?、原位雜交技術(shù)(In situ hybridization,ISH)和免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC)進(jìn)行比較時,在連續(xù)切片上分別使用三種技術(shù)檢測PRRSV,定量分析陽性結(jié)果表明,RNAscope~?具有更高的敏感性。圖像分析結(jié)果顯示,在肺臟中,RNAscope~?與ISH陽性信號的位置與數(shù)量基本一致,然而IHC結(jié)果顯示PRRSV陽性信號明顯少于前兩者。在胸腺組織中,RNAscope~?陽性信號在皮質(zhì)區(qū)大量出現(xiàn);ISH檢測中,陽性信號在皮質(zhì)區(qū)局部出現(xiàn);而IHC結(jié)果中,胸腺皮質(zhì)區(qū)PRRSV陽性信號較少。在淋巴結(jié)組織中,三種技術(shù)檢測PRRSV呈現(xiàn)的陽性信號出現(xiàn)的位置一致,但是RNAscope~?信號數(shù)量最多,IHC檢測結(jié)果次之,ISH陽性信號少于前兩者。初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示,RNAscope~?的敏感性顯著高于ISH和IHC。為擴展RNAscope~?和IHC技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍,本研究以PRRSV感染的組織石蠟切片為樣本,建立了RNAscope~?與IHC雙重染色技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合RNAscope~?獨特探針與IHC特異性抗原兩大優(yōu)勢,實現(xiàn)了在同一切片上核酸與蛋白的雙重檢測。在肺臟及淋巴結(jié)中,利用RNAscope~?檢測PRRSV結(jié)合IHC檢測巨噬細(xì)胞,結(jié)果顯示RNAscope~?與IHC均呈現(xiàn)出較好的特異性和敏感性。PRRSV感染宿主后,會引起細(xì)胞凋亡,基于此在組織切片上應(yīng)用RNAscope~?檢測宿主凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因Bid和Bcl-xl結(jié)合IHC檢測PRRSV雙重染色,結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)PRRSV感染組織中的Bid基因表達(dá)水平有上調(diào)趨勢,Bcl-xl基因表達(dá)水平有下調(diào)趨勢,表明該技術(shù)在檢測內(nèi)源性基因過程中也有良好表現(xiàn)。綜上,本研究成功建立了RNAscope~?與IHC雙重染色技術(shù)。本研究應(yīng)用RNAscope~?技術(shù)成功檢測到組織切片中的PRRSV核酸,同時證明該技術(shù)操作簡便,并具有高度的特異性、敏感性和重復(fù)性。RNAscope~?與IHC雙重染色結(jié)果證實該技術(shù)不僅在病毒檢測中具有高敏感性,在內(nèi)源基因表達(dá)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等基礎(chǔ)研究中也有廣泛的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651
【圖文】：

與呼吸綜合征是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive anvirus，PRRSV）引起的重要的豬傳染性疾病，世界動物衛(wèi)生組織（Office inte，OIE）將其列為 B 類傳染病。近三十年來給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)帶來沉重家推算，每頭十八周齡發(fā)病豬將造成接近 121.5 美元的經(jīng)濟損失(Nieuw重的經(jīng)濟學(xué)和生態(tài)學(xué)影響促使該病成為目前豬病領(lǐng)域中的研究熱點和重點，驗室正在對該病的致病機理進(jìn)行深入研究。原學(xué)特點 病毒粒子呈球形, 為直徑 60~65 nm 的有囊膜的 RNA 病毒(Wensvoort, 1991性，僅感染豬。目前該病毒有兩個基因型分別為歐洲型（1 型）和美洲型999)。在病毒分類學(xué)中，PRRSV 與馬動脈炎病毒（Equine arteritis virus，EA增高癥病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus，LDV）和猴出血熱病ic fever virus，SHFV）等同為尼多病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒rg et al., 1993)。妊娠母豬感染 PRRSV 會發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)出死胎或木乃伊豬會出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀，造成缺氧，從而出現(xiàn)機體末端例如耳朵發(fā)紫被稱為藍(lán)耳病(Rahe et al., 2017)或神秘豬病。

碩士學(xué)位論文 原位雜交技術(shù)。該技術(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)微拷貝技術(shù)增強對于 mRNA 的檢scope 技術(shù)的原理是基于堿基互補配對原則，結(jié)構(gòu)獨特的雙 Z 形探合，再通過信號放大系統(tǒng)標(biāo)記目的序列作為陽性信號呈現(xiàn)在鏡下（點在于雙 Z 探針的設(shè)計，該探針的結(jié)構(gòu)為三段式 Z 型，下端為靶標(biāo)中核酸結(jié)合的核心區(qū)域，長度約為 25 bp；上端為信號放大結(jié)合區(qū)統(tǒng)的骨架根據(jù)堿基互補配對原則結(jié)合，為信號結(jié)合提供支架，長度上端和下端的作用。探針的成對設(shè)計使得非目的序列上的單個 Z 探，大大降低了背景和噪點。該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)短序列 mRNA 甚至單個益于這一點，進(jìn)而可以擴展到 RNAscope 的一個特殊的功能，就是降存時間較長的樣本中，RNA 存在降解，但只要片段長度不小于 50 b技術(shù)的敏感性，克服了 RNA 容易降解的問題。

引入到這一診斷領(lǐng)域中能夠互補目前的主流檢測手段(Yu et al.)。Talita 等在豬各組織器官中檢測豬塞內(nèi)加谷病毒(Seneca valley virus，SVV)時發(fā)現(xiàn)，在臨床中認(rèn)為是機械損傷的舌面潰爛處RNAscope 檢測發(fā)現(xiàn)了 SVV 的存在，同時也通過 PCR 的技術(shù)確定了這一診斷的正確性，因此懷疑該病毒在損傷組織中易感(Resende et al., 2017)。同時 RNAscope 的技術(shù)優(yōu)勢為其在基礎(chǔ)研究中的推廣與接受奠定了基礎(chǔ)。Kim 等在對乳腺分葉狀腫瘤的惡化程度分級中，發(fā)現(xiàn)在 RNAscope 診斷結(jié)果中，隨著腫瘤惡性程度的加重，富含半胱氨酸的酸性基質(zhì)蛋白的 RNA 水平和蛋白水平均顯著上調(diào)，一定程度上證明了該類型蛋白與腫瘤惡化相關(guān)(Kim et al., 2017)。在研究炎癥的相關(guān)機理時，應(yīng)用 RNAscope 確定關(guān)鍵因子 ACN9不僅在肺臟上皮組織中存在，也是肺臟淋巴組織中的重要表達(dá)因子，深入研究發(fā)現(xiàn)將該因子沉默會促進(jìn)炎性因子的表達(dá)(Jeong et al., 2017)。通過對相關(guān)基因在神經(jīng)細(xì)胞病變區(qū)的分布和表達(dá)量改變的檢測，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)的不同調(diào)節(jié)機制(Kanaan et al., 2015)。利用不同的關(guān)鍵標(biāo)志物來區(qū)分不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞來研究病原或腫瘤發(fā)生時，巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的改變，同時針對重要細(xì)胞因子的檢測，也對胰腺癌的相關(guān)臨床癥狀進(jìn)行了簡單的解釋(Liou et al., 2017)。RNAscope 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和生物研究中得到高度的認(rèn)可，不僅能夠利用腫瘤標(biāo)記物來快速診斷癌癥的發(fā)生與發(fā)展，同時也為基礎(chǔ)研究提供了一個新的平臺和方向。目前，在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的各方面都應(yīng)用較少，但是 RNAscope 技在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的成功推廣提示著該技術(shù)也將為獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來一場技術(shù)的革命。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 周磊;楊漢春;姜平;童光志;閆恒普;;豬繁殖與呼吸綜合征綜合防控技術(shù)與應(yīng)用[J];中國畜牧雜志;2015年06期

2 楊漢春;;主要豬病流行現(xiàn)狀、防控面臨的問題與對策[J];獸醫(yī)導(dǎo)刊;2014年11期

3 孫廣力;蔡雪輝;鄭世民;孫剛;榮福龍;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒在豬動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞上的培養(yǎng)特性[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2010年10期

本文編號：2746285