發(fā)布時間：2020-07-06 16:07

【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)屬于α冠狀病毒屬,是引起新生仔豬腹瀉的主要病因,每年給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。豬小腸上皮是PEDV感染的靶細(xì)胞,是由絨毛區(qū)和隱窩區(qū)組成的多種細(xì)胞類型的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。目前用于體外研究PEDV的細(xì)胞模型缺乏小腸上皮復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu),限制了對PEDV的致病機(jī)理和調(diào)節(jié)宿主天然免疫應(yīng)答的研究。因此,建立一個能模擬體內(nèi)小腸上皮的細(xì)胞模型尤為必要。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展,體外培養(yǎng)的人或鼠腸類器官能模擬體內(nèi)腸上皮結(jié)構(gòu)。因此,本研究從豬不同腸段分離腸隱窩干細(xì)胞,其能夠在體外7天后分化成腸類器官,能重現(xiàn)腸上皮多種細(xì)胞類型的復(fù)雜結(jié)構(gòu),且能連續(xù)傳代和凍存復(fù)蘇。通過熒光定量PCR(qPCR)和間接免疫熒光(IFA)檢測發(fā)現(xiàn)小腸類器官對PEDV易感,能產(chǎn)生感染性病毒顆粒(TCID_(50)達(dá)10~4/mL)。IFA檢測證實(shí)PEDV可以感染多種類型的細(xì)胞(絨毛上皮細(xì)胞、干細(xì)胞和杯狀細(xì)胞)。進(jìn)一步通過qPCR和IFA檢測,發(fā)現(xiàn)回腸類器官和結(jié)腸類器官表現(xiàn)出不同腸段對PEDV敏感性的差異,與體內(nèi)結(jié)果一致,表明腸類器官保留著宿主遺傳特性。本研究還發(fā)現(xiàn)臨床分離株P(guān)EDV-JMS比細(xì)胞適應(yīng)株P(guān)EDV CV777在回腸類器官中復(fù)制地更好。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)PEDV在感染早期抑制回腸類器官中IFN產(chǎn)生,并且在回腸類器官中IFN-λ1比IFN-α誘導(dǎo)更強(qiáng)抗病毒基因的表達(dá)(ISG15、MxA、OASL和IFITM1),更有效抑制PEDV感染。Ⅲ型干擾素(IFN-λ)屬于IL-10家族成員,主要作用于黏膜上皮細(xì)胞。前期研究表明豬IFN-λ3比IFN-α更有效地抑制PEDV感染,但其抗病毒差異的機(jī)制尚不清楚,尤其是IFN-λ3誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄譜,還未見報(bào)道。為解析豬IFN-λ3抗黏膜病毒的分子機(jī)制以及與IFN-α抗PEDV活性的差異,本文通過RNA-seq比較了兩種IFN在豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄譜,發(fā)現(xiàn)IFN-λ3處理IPEC-J2細(xì)胞后誘導(dǎo)997個基因差異表達(dá)而IFN-α只誘導(dǎo)126個基因差異表達(dá),其中共同誘導(dǎo)差異表達(dá)基因110個。轉(zhuǎn)錄譜富集分析表明,IFN-λ3比IFN-α參與調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞中更多的細(xì)胞組分、分子功能等生物學(xué)過程,激活更多的信號通路,尤其是JAK-STAT信號通路。通過qPCR在IPEC-J2和小腸類器官上驗(yàn)證了RNA-seq結(jié)果,證實(shí)IFN-λ3比IFN-α更有效上調(diào)ISGs表達(dá)(MX2、IFIT3、OASL、OAS1、RSAD2和PLAC8)。通過克隆表達(dá)IFN-λ3誘導(dǎo)前10個基因中的rsad2和mx2基因,證實(shí)豬RASD2和MX2呈劑量反應(yīng)顯著抑制PEDV的感染�？傊�,本研究建立了一種可模擬體內(nèi)腸上皮的腸類器官模型,為探索PEDV發(fā)病機(jī)制以及宿主與豬腸道病毒之間相互作用的體外研究提供了一個堅(jiān)實(shí)的平臺,也為闡明IFN-λ抗PEDV的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。另外,通過對IFN-λ3和IFN-α誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄譜分析及驗(yàn)證為探索IFN在黏膜免疫中的抗病毒機(jī)制提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28
【圖文】：

圖 1.1 PEDV 基因組和病毒粒子結(jié)構(gòu)(Lee, 2015)Fig 1.1 PEDV genome organization and virion structure(Lee, 2015)3 PEDV 感染細(xì)胞模型前PEDV的復(fù)制和繁殖主要是在來源于非洲綠猴腎臟的Vero細(xì)胞上進(jìn)行(Wangetal

圖 1.2 先天免疫信號通路和 PEDV 蛋白的拮抗作用(Koonpaew et al., 2019)Fig 1.2 Innate immune signaling pathways and antagonism by PEDV poteins(Koonpaew et al., 2019)2 腸類器官的研究進(jìn)展

圖 1.3 腸類器官結(jié)構(gòu)模型(Bartfeld, 2016)Fig 1.3 The model of enteroids(Bartfeld, 2016)器官模擬腸道上皮獨(dú)特的結(jié)構(gòu)微環(huán)境為研究腸道病毒的各種生物學(xué)方面提供于人輪狀病毒（RV）來說，用于培養(yǎng) RV 的常規(guī)體外方法是在穩(wěn)定的細(xì)胞系中繁猴腎細(xì)胞（MA104）、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（HT-29 和 Caco-2）或原代細(xì)胞系，

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本文編號：2743852