本文關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒文登株和石林株毒力致弱及毒力相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：羊口瘡(Contagious pustular dermatitis,CPD),也被稱作接觸傳染性膿皰皮炎,是由羊口瘡病毒(Orf virus,ORFV)引起的一種使山羊、綿羊及一些野生反芻動(dòng)物等發(fā)生傳染性膿瘡的動(dòng)物傳染性疾病。隨著我國(guó)山羊養(yǎng)殖規(guī)模和密度的不斷增加,各地區(qū)羊只相互頻繁引種交易,使得羊口瘡的發(fā)病率和羔羊致死率居高不下,給各地養(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。雖然目前有使用滅活疫苗或弱毒疫苗來進(jìn)行羊口瘡病的防治,但其保護(hù)率和交叉免疫效果仍然不佳,加之與羊口瘡病毒毒力相關(guān)的基因參與到宿主免疫逃避中,給該病的防控也增加了難度。本研究以采集的山東文登、云南石林羊口瘡痂毒為原料,以犢牛睪丸原代細(xì)胞、1月齡羔羊?yàn)樵囼?yàn)材料,通過特征性細(xì)胞病變觀察、特異基因B2L的PCR檢測(cè)、病毒滴度測(cè)定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)及病毒傳代致弱、羊體安全性試驗(yàn)、免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)等方法進(jìn)行野毒株分離鑒定和毒力致弱研究;并克隆羊口瘡病毒文登、石林強(qiáng)弱毒株的GIF、vIL-10基因,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,比較其在強(qiáng)弱毒間的基因差異。獲得試驗(yàn)結(jié)果如下:1.羊口瘡病毒文登株與石林株的分離與鑒定結(jié)果表明:痂毒盲傳至第4代時(shí)產(chǎn)生羊口瘡特征性細(xì)胞病變,測(cè)得第5代文登株和石林株分離病毒滴度分別為106.56TCID50/mL,107.30 TCID50/mL;B2L基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的其他國(guó)內(nèi)外31個(gè)參考毒株B2L基因相應(yīng)部分的核苷酸序列相似性均達(dá)到99%;第5代細(xì)胞適應(yīng)毒劃痕接種羔羊3天后引起羔羊發(fā)病,癥狀與臨床上自然感染羊口瘡的羊只相同。結(jié)果表明,本試驗(yàn)成功分離得到ORFV山東文登株和云南石林株;2.羊口瘡病毒文登株和石林株毒力致弱及GIF、vIL-10基因生物信息學(xué)分析結(jié)果如下:傳至90代的羊口瘡病毒文登株和石林株的病毒滴度分別為103.40 TCID50/mL、103.90TCID50/mL,隨傳代次數(shù)增多,毒力越來越弱;兩株P(guān)90毒株劃痕接種羔羊后均未現(xiàn)羊口瘡特征性病變;免疫攻毒結(jié)果顯示,8只免疫羊得到100%的保護(hù)。表明ORFV文登株和石林株病毒經(jīng)細(xì)胞連續(xù)傳代后毒力減弱,免疫原性良好,試驗(yàn)獲得2株羊口瘡病毒的弱毒株。生物信息分析結(jié)果顯示:4株病毒株的GIF基因組全長(zhǎng)均為798 bp,編碼265個(gè)氨基酸。石林強(qiáng)弱毒株間GIF基因核酸共發(fā)生4處變異,文登強(qiáng)弱毒間有2個(gè)變異位點(diǎn);石林強(qiáng)弱毒株間GIF基因存在4個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異,文登強(qiáng)弱毒株間有1個(gè)氨基酸變異。文登株氨基酸變異意義不大,石林強(qiáng)毒株在致弱過程由于4個(gè)位點(diǎn)氨基酸產(chǎn)生變異,導(dǎo)致在第250位附近α螺旋結(jié)構(gòu)消失;4株病毒株的vIL-10基因組全長(zhǎng)均為558 bp,編碼的氨基酸個(gè)數(shù)均為185個(gè)。文登強(qiáng)弱毒株vIL-10基因核酸有27處變異,氨基酸發(fā)生13處突變;石林強(qiáng)弱毒株間vIL-10基因核酸共發(fā)30處變異,比文登株多了第32位(T→C)、61位(G→A)、88位(G→A)位突變;導(dǎo)致氨基酸發(fā)生16處突變,比文登株多了11位(Val→Ala)、21位(Asp→Asn)、30位(Gly→Ser)突變。證明羊口瘡病毒毒力相關(guān)基因在強(qiáng)弱毒株之間存在不同程度的基因變異。在進(jìn)一步的分析中得知,這些變異直接導(dǎo)致了石林、文登強(qiáng)弱毒株20-40位、120位、160位左右的氨基酸殘基形成α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲的概率的變化;氨基酸的親水性也發(fā)生相對(duì)變化;強(qiáng)、弱毒株間vIL-10蛋白抗原指數(shù)也發(fā)生多處變化。
【關(guān)鍵詞】：羊口瘡 分離鑒定 毒力致弱 生物信息分析
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻(xiàn)綜述13-24
• 第一章 羊口瘡研究進(jìn)展13-24
• 1.1 前言13
• 1.2 分子生物學(xué)特征13-15
• 1.2.1 病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)13-14
• 1.2.2 病毒的基因組結(jié)構(gòu)14-15
• 1.2.3 病毒增殖培養(yǎng)特性15
• 1.3 流行病學(xué)特征15
• 1.4 臨床癥狀與病理變化15-16
• 1.5 與發(fā)病機(jī)制和病毒毒力相關(guān)的基因研究16-20
• 1.5.1 Bcl-2 樣細(xì)胞凋亡抑制因子16-17
• 1.5.2 NF-κB信號(hào)通路抑制劑17
• 1.5.3 干擾素抑制基因（OVIFNR）17
• 1.5.4 病毒白細(xì)胞介素-10（ORFV-IL-10）17-18
• 1.5.5 趨化因子阻遏蛋白（CBP）18
• 1.5.6 GM-CSF/IL-2 抑制因子（GIF）18-19
• 1.5.7 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）19-20
• 1.6 鑒別與診斷方法20-22
• 1.6.1 組織病理學(xué)檢查20
• 1.6.2 電子顯微鏡觀察20
• 1.6.3 免疫電子顯微鏡觀察20
• 1.6.4 病毒分離與鑒定20-21
• 1.6.5 PCR檢測(cè)21
• 1.6.6 ELISA檢測(cè)21
• 1.6.7 病毒中和試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)21-22
• 1.6.8 Western blotting22
• 1.6.9 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）22
• 1.7 本研究的目的意義22-24
• 試驗(yàn)研究24-54
• 第二章 羊口瘡病毒文登株與石林株的分離與鑒定24-32
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 病料24
• 2.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物24
• 2.1.3 細(xì)胞24
• 2.1.4 主要試劑24
• 2.1.5 主要儀器24-25
• 2.1.6 主要溶液配方25
• 2.2 方法25-27
• 2.2.1 病料采集與處理25
• 2.2.2 犢牛睪丸原代細(xì)胞的制備25-26
• 2.2.3 羊口瘡病毒分離26
• 2.2.4 病理組織切片的制備26
• 2.2.5 PCR鑒定26
• 2.2.6 病毒滴度測(cè)定26
• 2.2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)26-27
• 2.3 結(jié)果27-30
• 2.3.1 羊口瘡患病羊痂皮組織病理學(xué)觀察27
• 2.3.2 分離病毒引起的細(xì)胞特征性病變27-28
• 2.3.3 分離毒株的PCR檢測(cè)28
• 2.3.4 病毒滴度測(cè)定結(jié)果28-29
• 2.3.5 病毒分離株動(dòng)物回歸試驗(yàn)29-30
• 2.4 討論30-31
• 2.5 小結(jié)31-32
• 第三章 羊口瘡病毒文登株和石林株毒力致弱及強(qiáng)弱毒株毒力相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析32-54
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 病毒32
• 3.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物32
• 3.1.3 細(xì)胞株和菌株32
• 3.1.4 主要試劑32
• 3.1.5 主要儀器32
• 3.1.6 主要溶液配方32-33
• 3.2 方法33-36
• 3.2.1 羊口瘡病毒文登株和石林株毒力致弱33-34
• 3.2.2 羊口瘡病毒文登株和石林株強(qiáng)弱毒株間GIF、vIL-10生物信息學(xué)分析34-36
• 3.3 結(jié)果36-51
• 3.3.1 羊口瘡病毒文登株和石林株毒力致弱36-40
• 3.3.2 羊口瘡病毒文登、石林強(qiáng)弱毒株GIF、vIL-10基因擴(kuò)增40-42
• 3.3.3 基因的生物信息學(xué)分析42-51
• 3.4 討論51-53
• 3.4.1 病毒的致弱及弱毒株鑒定51-52
• 3.4.2 基因的生物信息學(xué)分析52-53
• 3.5 小結(jié)53-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 致謝62-63
• 作者簡(jiǎn)介63

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：274353