發(fā)布時間：2020-07-01 15:15

【摘要】：禽白血病病毒(ALV)自從1989年報道以來,給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴重的危害。該病可使感染雞群產蛋量下降、繼發(fā)或/和混合感染多種疾病,引起雞群的死淘率上升,免疫抑制增強,以及多種類型的腫瘤,損失重大。該病到目前為止還沒有有效的疫苗和治療方法。p27蛋白(ALV-p27)是病毒編碼的群特異性衣殼蛋白,在病毒中含量高,有許多易于檢測的抗原位點,常被用于ELISA和免疫熒光的檢測。有研究表明p27可以影響一些細胞因子的表達,提示ALV-p27可能在病毒感染引起的免疫抑制中發(fā)揮一定的作用。為了明確p27對免疫的影響,本研究在構建pcDNA3.1-p27全長真核表達載體,以及p27分段表達載體的基礎上,探究p27蛋白的免疫抑制機理。1.ALV-p27抑制DF-1細胞對LPS和Poly(I:C)的刺激為了研究在LPS和Poly(I:C)刺激后,過表達的ALV-p27在DF-1細胞中產生的免疫抑制作用,本研究利用實驗室已構建的pcDNA3.1-p27真核表達載體為模板,并成功克隆構建了 p27的兩個分段表達載體pcDNA3.1-p27A(1-480bp)和pcDNA3.1-p27B(241-720bp)。將全長的p27質粒和空載體質粒分別轉染DF-1細胞中,隨后用LPS和Poly(I:C)刺激物刺激,分別在1,6,12和24h收集細胞,提取RNA,利用Real-timePCR檢測IL-1β、IL-6、IFN-β等細胞因子的表達情況。結果表明,DF-1細胞中過表達的p27蛋白顯著影響免疫相關細胞因子的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn),分段表達載體pcDNA3.1-p27A(1-480bp)和 pcDNA3.1-p27B 轉染的 DF-1 細胞中,pcDNA3.1-p27B 具有抑制細胞因子表達的作用,提示p27蛋白發(fā)揮免疫抑制作用的位點位于480-720bp,即蛋白C端。這一結果說明ALV-p27蛋白可能通過抑制細胞因子的表達抑制機體的免疫反應。2.ALV-p27抑制DF-1細胞免疫反應機理的初步研究為了進一步探討ALV-p27在DF-1細胞中產生免疫抑制作用的相關機理,利用Real-time PCR的方法檢測了 LPS和Poly(I:C)刺激細胞后,相關信號通路途徑的一些關鍵分子的基因表達,結果表明,LPS刺激后,其信號通路中的IRAK4和IRF-7基因表達受到明顯抑制;而Poly(I:C)刺激后,基因水平上該信號通路的常見分子未發(fā)生顯著變化。利用雙熒光酶報告系統(tǒng)進一步研究發(fā)現(xiàn),Poly(I:C)刺激后,p27蛋白可通過抑制IFN-β基因表達的啟動子抑制基因表達;LPS刺激后可抑制IRF-7的啟動子活性產生免疫抑制作用;而MAPK相關信號通路分子蛋白磷酸化實驗結果表明,LPS和Poly(I:C)刺激后,p27蛋白明顯抑制p38蛋白的磷酸化水平從而抑制下游基因的表達。以上實驗結果表明,ALV-p27可能通過抑制信號通路相關基因分子表達、抑制細胞因子表達的啟動以及影響信號通路關鍵蛋白的磷酸化發(fā)揮免疫抑制作用。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

（ＩＲＡＫ）與死亡結構域相結合，從而連接Ｔｏｌｌ樣受體與下游的蛋白激酶，進行信號逡逑ＭｙＤ８８和ＴＲＡＦ６還可以結合ＩＲＦ－７，并募集ＩＲＡＫＩ磷酸化的ＩＲＦ－７，導致核易位。逡逑８是通過募集一些關鍵的蛋白復合物或家族（如ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４等）來完逡逑轉導的，這些蛋白家族的５’端有一個可以與ＭｙＤ８８死亡結構域相結合的死亡結構逡逑’端是絲氨酸／蘇氨酸激酶結構域［３５１。首先，ＭｙＤ８８與ＩＲＡＫ４形成復合物，其次，被逡逑的ＩＲＡＫＩ和ＩＲＡＫ２形成復合體，并與ＴＲＡＦ６相互作用，接著ＴＲＡＦ６結合Ｅ２泛逡逑酶，泛素化修飾ＩＲＡＫＩ和ＴＲＡＦ６，導致ＴＡＫ１的激活＠１。進而激活ＭＡＰ和ＮＦ－ｋＢ逡逑從而導致趨化因子、Ｉ型干擾素、細胞因子的轉錄和翻譯�！醴牵停模福敢蕾囃緩�，逡逑的轉導是因為巨噬細胞被ＴＬＲ３和ＴＬＲ４的ＰＡＭＰＳ刺激產生的。非依賴途徑的機制逡逑依賴途徑，通過募集ＲＩＰ１和ＴＲＡＦ６到ＴＲＩＦ的特定區(qū)域，使其相互作用后激活ＴＢＫ１。逡逑Ｅ３連接酶－ＮＲＤＰ１的調節(jié)這兩個途徑，避免病毒入侵后炎癥因子過多而導致機體損逡逑邋ＴＲＡＦ３同樣在這兩個途徑中起關鍵作用，ＴＲＡＦ３的泛素化是非依賴途徑產生［型逡逑的必要組成部分，同時，它的泛素化降解可以促進依賴途徑中細胞因子的表達［３８１。逡逑

－－１８Ｓ逡逑Ｒ邋５，－ＴＴＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴ－３，逡逑１．５禽白血病衣殼蛋白ｐ２７真核表達載體的構建逡逑將實驗室己經構建好的ｐｃＤＮＡ３．１－ｐ２７質粒用ＢａｍＨ邋Ｉ和Ｘｈｏ邋Ｉ進行雙酶切，鑒定正確的陽性克隆質粒送南京金斯瑞生物有限公司進行測序。設計帶有ｆｌａｇ標分段表達的引物ｌ－４８０（ｐ２７Ａ段），２４１？７２０（ｐ２７Ｂ段）見圖１，ＰＣＲ擴增引物序列如線分別為ＢａｍＨ邋Ｉ和Ｘｈｏ邋Ｉ酶切位點：逡逑ｐ２７Ａ：邋Ｆ：邋ＧＣＧＧＡＴＣＣａｔｇｃｃｔｇｔａｇｔｇａｔｔａａｇ逡逑Ｒ：邋ＧＣＣＩＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣｔｃｃｃｔｇｃｇｔａａｔｇｔｃｃｇｃ逡逑ｐ２７Ｂ：邋Ｆ：ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧｇｔｔａｔａｇｃｇｇｃａｇｃｃａｃｔ，逡逑Ｒ：ＧＣＣＩＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔａｔｇｃｃｔｔｇ逡逑ＰＣＲ邋程序：９５邋°Ｃ預變性邋５ｍｉｎ，然后邋９４°Ｃ邋ｌｍｉｎ，５２°Ｃ３０ｓ，７２°Ｃｌｍｉｎ，３５邋７２０Ｃ７ｍｉｎ，４°Ｃ循環(huán)。逡逑

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本文編號：2736929