【摘要】：口蹄疫被OIE列為法定上報的動物疫病,是國際貿(mào)易關注的重要疫病之一,其對經(jīng)濟和政治影響巨大。為有效防控口蹄疫,不同國家和地區(qū)根據(jù)國情及口蹄疫流行情況采取撲殺或疫苗免疫結合撲殺的措施,我國采用疫苗免疫結合撲殺的綜合防控措施。為保證口蹄疫防控效果,疫苗產(chǎn)品質量至關重要。本研究針對口蹄疫亞洲1型疫苗種毒培養(yǎng)、產(chǎn)品質量檢驗過程中發(fā)生的異常展開研究,旨在為種毒監(jiān)測、產(chǎn)品質量控制提供新的思路。研究發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒Asia-1/HN/06在適應無血清懸浮培養(yǎng)BHK-21細胞后VP1基因的3’末端(即第619位核苷酸后)有12nt插入(GTTGACTTAGTA,編碼VDLV)。高通量測序證實病毒在無血清懸浮培養(yǎng)BHK-21細胞第4代發(fā)生插入變異,并且變異病毒所占比例隨病毒傳代逐漸增加。通過蝕斑克隆分離出含12nt插入變異毒株,命名為Vac-Asia-1-VDLV。為確定12nt插入序列的來源,通過核苷酸序列Blast分析及宿主細胞轉錄組測序,確定該序列來源于BHK-21細胞mRNA。通過對樣品reads數(shù)據(jù)庫分析,BHK-21細胞轉錄組中有3條mRNA含12nt相同序列,結合側翼匹配序列長度、RNA重組機制以及mRNA變化水平分析,其中secernin-3蛋白的編碼基因表達量明顯高于對照組,并且該mRNA含有與12nt及兩翼最長匹配序列,其作為供體與病毒重組的可能性最高。生物學特性研究結果表明Vac-Asia-1-VDLV病毒在BHK-21細胞中蝕斑形態(tài)變化不明顯,可在CHO-K1及衍生細胞中生長,病毒滴度超過1×10~5PFU/mL。而Asia-1/HN/06在CHO系列細胞中感染率極低,沒有蝕斑。表明Vac-Asia-1-VDLV能感染缺失整聯(lián)蛋白及HS受體的細胞,可利用第三類受體。經(jīng)反向遺傳操作將編碼VDLV的12nt序列插入到病毒O/CHA/90,結果表明其蝕斑形態(tài)、生長曲線及對CHO-K1系列細胞感染特性與親本株O/CHA/90病毒相比無明顯變化,說明12nt插入序列對病毒在BHK-21細胞的生長特性影響不大,對病毒利用第三類受體影響有限。病毒對乳鼠的半數(shù)致死量(LD_(50))及對牛的致病力結果顯示Vac-Asia-1-VDLV及Asia-1/HN/06病毒對乳鼠的致病力差異不明顯而對牛的致病力差異較大。Vac-Asia-1-VDLV病毒接種的3頭牛均未出現(xiàn)臨床癥狀及體溫升高情況,未出現(xiàn)明顯病毒血癥。Asia-1/HN/06病毒接種牛表現(xiàn)出明顯的口蹄疫癥狀并有體溫反應,出現(xiàn)明顯的病毒血癥和排毒現(xiàn)象。表明Vac-Asia-1-VDLV對牛的致病力明顯減弱,分析原因為RGD突變?yōu)镚GD以及12nt插入序列影響了Asia-1型口蹄疫病毒對牛的致病力。綜上所述,本研究首次報道了宿主細胞mRNA與口蹄疫病毒發(fā)生重組,通過轉錄組測序分析了供體mRNA來源,研究了重組病毒受體利用情況及對本動物致病力等的影響,豐富了口蹄疫遺傳變異內(nèi)容。本研究中亞洲1型口蹄疫病毒適應細胞產(chǎn)生的變異對免疫效果影響很大,也為口蹄疫疫苗生產(chǎn)中種毒監(jiān)測的必要性提供了充分證據(jù)。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

圖 1.1Asia-1 型口蹄疫病毒代表毒株遺傳進化樹圖（Mega7.0.26）注：“○■▲●△%健鋇缺曄段萌旱拇磯局輟＠昧誚臃ǘ云浣方辛朔治觶嗬胨悴捎米畬蠛銑傷迫環(huán)�。Figure1.1 Evolutionary tree of the representative strains ofAsia-1(analysis by Mega7.0.26)Note: “○■▲●△%健眒eans of the representative strain of Group.The evolutionary history is

圖 1.2 研究線路圖Figure 1.2 Research line diagram1.3.2 主要內(nèi)容1.3.2.1 研究經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)的 Asia-1/HN/06 疫苗免疫失敗原因疫苗免疫血清抗體效價測定，疫苗毒株序列分析。

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本文編號：2736674