【摘要】：牛乳頭狀瘤(Bovine papillomatosis, BP)是由牛乳頭瘤病毒(Bovine papilloma-virus, BPV)引起腫瘤發(fā)生的慢性增生性疾病。本病無明顯的季節(jié)性和地區(qū)性,為奶牛最常見的腫瘤疾病,多發(fā)于體表、粘膜及某些器官。牛乳頭狀瘤易復(fù)發(fā),進而發(fā)展為癌癥,導(dǎo)致動物死亡,最終造成肉類、奶業(yè)和皮革類行業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟損失,而目前尚無有效疫苗來預(yù)防牛乳頭瘤病的發(fā)生。E5蛋白是BPV的主要腫瘤蛋白,通過干擾細胞生長抑制和細胞周期調(diào)控來發(fā)揮作用,與生長因子受體相互作用,激活細胞增殖。BPV E5蛋白參與細胞轉(zhuǎn)化,且在病毒感染初始以及整個過程中都有表達,改變正常細胞對生長因子的應(yīng)答,阻礙細胞表面主要組織相容性復(fù)合物的表達。鑒于這種種作用,E5具有被用來研發(fā)DNA疫苗的重大意義。因此,對于BPV相關(guān)功能蛋白的研究可為今后BPV疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。另外,隨著人類性病中尖銳濕疣發(fā)病率的急速上升和宮頸癌、肛門癌等疾病的增多,HPV感染越來越引起人們的關(guān)注。BPV可以作為研究HPV感染,HPV與宿主以及與環(huán)境因素之間的相互作用關(guān)系的體內(nèi)模型,能夠為人乳頭瘤病的檢測與治療提供理論依據(jù)。 本實驗克隆了牛乳頭瘤病毒13型海南株的全基因組,并構(gòu)建pEGFP-N1-E5重組真核表達載體,在HEK293細胞中表達。利用熒光觀察、FCM (Flow Cytometry Method)檢測和Western blot鑒定來驗證重組蛋白的表達,為牛乳頭瘤病的預(yù)防性和治療性疫苗的研發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。以下為本實驗的研究方法和主要結(jié)果：1.牛乳頭瘤病毒基因分型與全基因組的克隆 本研究以來自�？谀侈r(nóng)場黃牛的牛乳頭瘤病料組織為材料,提取病毒DNA。根據(jù)乳頭瘤病毒衣殼蛋白L1基因的保守序列設(shè)計的簡并引物FAP59/FAP64進行PCR檢測,經(jīng)過測序和序列比對對該BPV進行了基因分型。結(jié)果顯示,患病黃牛所感染的BPV類型為BPV-13,命名為BPV-13-HN。 設(shè)計BPV-13-HN基因型特異性引物,通過擴增、測序、拼接、對比后獲得BPV13-HN全基因組序列。實驗病毒株基因組全長7961bp,包括8個開放閱讀框(open reading frame, ORF),分別為早期基因區(qū)E1、E2、E4、E5、E6、E7和晚期基因區(qū)L1、L2。 2. BPV-13-HNE5蛋白在HEK293細胞中的表達 用PCR擴增E5基因,以pEGFP-Nl為真核表達載體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染進入HEK293細胞。進行熒光顯微觀察,流式細胞儀檢測和Western Blot鑒定。結(jié)果表明：本實驗成功構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒,可成功表達E5蛋白,為下一步穩(wěn)定表達E5的細胞系的構(gòu)建做好初步準(zhǔn)備,為E5蛋白的研究及相關(guān)疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 齊長明,許鴻章,陳汝賢;博寧霉素霜劑對牛乳頭瘤病毒所致奶牛乳頭瘤的療效觀察[J];中國抗生素雜志;2003年09期

2 ;[J];;年期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 史巧蕓;牛乳頭瘤病毒13型海南株的全基因組克隆及E5蛋白的真核表達[D];海南大學(xué);2015年

2 賀志昊;新疆北疆地區(qū)牛乳頭瘤病毒流行株基因分型及其衣殼蛋白表達研究[D];石河子大學(xué);2014年

本文編號：2736077