【摘要】：外泌體(Exosomes)是細(xì)胞向胞外分泌的一類雙層膜包被的囊泡,直徑為30-150nm。外泌體可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)或核酸的轉(zhuǎn)運(yùn),從而參與多種生理或病理過程。以前的研究發(fā)現(xiàn),某些病毒可以通過外泌體攜帶其基因組或病毒粒子,從而介導(dǎo)病毒在細(xì)胞之間的傳遞或建立感染。我們前期在豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn),PRRSV感染細(xì)胞后外泌體釋放途徑被激活。同時(shí),國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn),從PRRSV感染豬的血清中提取的外泌體中含有PRRSV部分編碼蛋白。但是,外泌體是否能夠攜帶PRRSV基因組RNA或病毒粒子從而介導(dǎo)病毒在細(xì)胞之間的擴(kuò)散尚不清楚。因此,本研究開展了外泌體在PRRSV感染中的作用研究,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染細(xì)胞的外泌體攜帶病毒的基因組RNA,分泌的外泌體可以建立感染。更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)的PRRSV感染不能被PRRSV特異性中和抗體中和,是PRRSV逃逸中和抗體作用的一種策略。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.PRRSV感染細(xì)胞釋放的外泌體(PRRSV-exosome)提取與純化為了獲得無游離PRRSV污染的外泌體,我們先采用PEG沉淀法富集PRRSV感染細(xì)胞上清中的外泌體,經(jīng)超高速離心去除雜蛋白,然后通過CD63磁珠免疫親和法對(duì)提取的外泌體進(jìn)行純化。通過Western blot檢測(cè)、電鏡觀察和免疫金標(biāo)記技術(shù)對(duì)提取的外泌體純度進(jìn)行檢測(cè)。Western blot結(jié)果證實(shí)提取的外泌體含有外泌體標(biāo)志蛋白CD9,CD63和Alix,但未檢測(cè)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白GRP94;電鏡下觀察到提取的外泌體呈典型的囊泡結(jié)構(gòu),大小為30~150nm;免疫金標(biāo)記技術(shù)能檢測(cè)到外泌體的標(biāo)記蛋白Alix,但檢測(cè)不到PRRSV的病毒粒子蛋白nsp2和GP4。上述檢測(cè)結(jié)果表明提取的外泌體純度高,且無游離的病毒粒子污染。2.PRRSV-exosome包含病毒成分采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對(duì)純化的外泌體進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)外泌體中含有216種宿主蛋白,大部分是以前報(bào)道的外泌體分泌蛋白。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)純化的外泌體中含有PRRSV的3種結(jié)構(gòu)蛋白(GP5、M和N),用針對(duì)這三種結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體通過Western blot檢測(cè)純化的外泌體,證實(shí)這三種結(jié)構(gòu)蛋白確實(shí)包含在純化的外泌體中。進(jìn)一步通過RT-PCR分析了純化的外泌體中是否包含PRRSV基因組RNA,將PRRSV的基因組分成5個(gè)重疊的片段進(jìn)行檢測(cè),可以成功擴(kuò)增5個(gè)重疊的片段,提示純化的外泌體中可能含有PRRSV的完整基因組RNA。3.PRRSV-exosome對(duì)允許細(xì)胞和非允許細(xì)胞均具有感染性將純化的PRRSV-exosome接種PRRSV允許細(xì)胞PK-15~(CD163)和Marc-145細(xì)胞,通過觀察細(xì)胞病變、檢測(cè)病毒蛋白表達(dá)和TCID_(50)測(cè)定分析PRRSV-exosome是否具有感染性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在兩種細(xì)胞上均能觀察到PRRSV所引起的典型細(xì)胞病變,間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和Western blot均能檢測(cè)到PRRSV N蛋白表達(dá),TCID_(50)檢測(cè)證實(shí)外泌體感染所獲得的病毒滴度與PRRSV感染細(xì)胞所獲得的病毒滴度無顯著差異。進(jìn)一步將PRRSV-exosome接種PRRSV的非允許細(xì)胞PK-15,同樣能觀察到典型的細(xì)胞病變和PRRSV N蛋白的表達(dá),說明PRRSV-exosome在PRRSV允許細(xì)胞和非允許細(xì)胞上均能建立增殖性感染。4.外泌體釋放抑制劑能抑制PRRSV-exosome介導(dǎo)的PRRSV傳播采用Transwell system建立PK-15~(CD163)和PK-15細(xì)胞的共培養(yǎng)模型,檢測(cè)在共培養(yǎng)體系中加入外泌體抑制劑GW4869后兩種細(xì)胞中PRRSV感染與增殖情況。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),加入抑制劑后不影響PK-15~(CD163)細(xì)胞中病毒基因組RNA水平和nsp2蛋白表達(dá),而PK-15細(xì)胞中病毒RNA水平和nsp2的表達(dá)量均顯著降低,說明外泌體釋放抑制劑能抑制外泌體介導(dǎo)的PRRSV傳播,同時(shí)也間接證實(shí)PRRSV-exosome能在PRRSV非允許細(xì)胞上建立增殖性感染。5.PRRSV中和抗體不能阻斷PRRSV-exosome介導(dǎo)的PRRSV傳播將PRRSV特異性中和抗體處理的PRRSV-exosome和PRRSV分別接種PK-15~(CD163)細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞,IFA和Western blot檢測(cè)PRRSV N蛋白或nsp2蛋白的表達(dá),結(jié)果經(jīng)中和抗體處理過的PRRSV所接種的細(xì)胞中N蛋白和nsp2蛋白表達(dá)均顯著降低,而中和抗體處理過的PRRSV-exosome接種的細(xì)胞中N蛋白和nsp2蛋白表達(dá)均無明顯變化。進(jìn)一步采用Transwell system共培養(yǎng)PK-15~(CD163)和Marc-145細(xì)胞,通過熒光定量RT-PCR檢測(cè)中和抗體對(duì)PRRSV-exosome感染性的影響,結(jié)果與對(duì)照相比,兩種細(xì)胞中PRRSV RNA水平無顯著差異,并且在PK-15~(CD163)和原代豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)的共培養(yǎng)模型中也獲得了同樣的結(jié)果,說明中和抗體不影響PRRSV-exosome介導(dǎo)的PRRSV傳播。6.PRRSV N蛋白可通過外泌體途徑激活NF-κB信號(hào)通路并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)由于PRRSV感染細(xì)胞的外泌體含有病毒的N蛋白,而以前的研究證實(shí)PRRSV N蛋白具有誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的特性。為了探討N蛋白是否可以通過外泌體途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng),將N蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞并從轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中純化外泌體(N-exosome),Western blot檢測(cè)證實(shí)純化的外泌體中含有N蛋白。用純化的外泌體處理PK-15~(CD163)細(xì)胞,檢測(cè)NF-κB的激活和炎癥因子表達(dá),發(fā)現(xiàn)含有N蛋白的外泌體可激活NF-κB的熒光素酶活性、促進(jìn)p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn),IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES等炎癥因子mRNA水平也顯著上調(diào),而且在PAM細(xì)胞上也觀察到同樣的結(jié)果,說明N-exosome可激活NF-κB信號(hào)通路并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.28
【圖文】：

1圖 1-1 外泌體分泌示意圖及電鏡圖（Colombo M et al 2014）Fig. 1-1 Schematic representation of the different types of membrane vesicles released beukaryotic cells and electron microscopy image of fusion of a MVB with the PM

圖 1-2 外泌體生成機(jī)制示意圖（Kowal J et al 2014） Schematic representation of the origin and release of exosomes by eukar泌體的分子組成

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本文編號(hào)：2734027