發(fā)布時間：2020-06-28 03:52

【摘要】：2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)不僅可以感染仔豬,也可以感染人類,是危害養(yǎng)豬業(yè)及其從業(yè)相關(guān)人員的重要的人畜共患病病原體。豬鏈球菌病已經(jīng)出現(xiàn)40多年了,但是到目前為止仍不斷有新的感染病例出現(xiàn),且在東南亞等國,該疾病的流行趨勢沒有減弱。中國曾經(jīng)爆發(fā)了兩次大規(guī)模的人感染豬鏈球菌的群體公共衛(wèi)生事件,且多數(shù)患者因細(xì)菌感染而引發(fā)了中毒性休克綜合征(streptococcal toxic shock syndrome,STSS),從而無法扭轉(zhuǎn)病程,最終62.7%~81.3%的患者死亡。本課題組密切關(guān)注這兩次突發(fā)感染事件,從中分離到了導(dǎo)致這兩次疾病流行的高致病性2型豬鏈球菌,S.suis 98HAH12和S.suis 05ZYH33,并對其進(jìn)行了詳細(xì)的生物學(xué)特性研究和基因組學(xué)特性分析。其中,我們確定高致病性2型豬鏈球菌所特有的一個大小約為89 kb的致病島(89K pathogenicity island,89K PAI),是導(dǎo)致這兩次疾病流行致死率較高的主要原因,且89K PAI上含有毒力因子(virulence-associated factor,VAF)、二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system,TCSTS)和四型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system,T4SS)等與細(xì)菌致病性密切相關(guān)的基因元件。已鑒定出的豬鏈球菌的毒力因子有20多個,其中最主要的是莢膜多糖(capsular polysaccharides,CPS)和豬鏈球菌溶血素(suilysin,SLY),CPS不僅可以為細(xì)菌提供保護(hù)屏障,還參與細(xì)菌對宿主細(xì)胞的抗吞噬能力;SLY可以增加細(xì)菌密度,促進(jìn)細(xì)菌引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)。其他毒力因子也參與到細(xì)菌與宿主的相互作用和促進(jìn)細(xì)菌透過宿主的血腦屏障等。但是,豬鏈球菌毒力的來源及分化尚不清楚,尋找有效的預(yù)防手段是防治豬鏈球菌病的長遠(yuǎn)目標(biāo)。因此本課題以從流行區(qū)豬群中分離到的一株不致病的2型豬鏈球菌為研究基礎(chǔ),通過對其進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定、全基因組測序和比較基因組學(xué)分析,探討豬鏈球菌各菌株之間毒力演化和基因組重排的方式,探索可以預(yù)防該疾病的疫苗。主要研究內(nèi)容和實(shí)驗結(jié)果如下:1.2型豬鏈球菌05HAS68生物學(xué)特性的鑒定:分別對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)觀察和革蘭染色,用分光光度計法測定細(xì)菌的溶血活性,列舉活菌數(shù)目測定細(xì)菌的全血存活能力。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)菌對Hep-2細(xì)胞的粘附能力,用梅里埃生化檢測卡鑒定細(xì)菌的生化反應(yīng)類型。通過以上實(shí)驗我們確定S.suis 05HAS68與高致病性菌株S.suis 05ZYH33相比,是一株具有較高粘附能力但溶血活性較差的血清2型豬鏈球菌。進(jìn)一步利用16S r RNA基因分型和多位點(diǎn)序列分型,證明該菌株屬于豬鏈球菌屬,ST28型。2.2型豬鏈球菌05HAS68全基因組測序及全基因組注釋:利用二代測序技術(shù)Ion torrent PGM測序儀,分別構(gòu)建待測基因組的測序文庫,其中Mate-pair 4 kb庫和shotgun小片段隨機(jī)庫分別達(dá)到127×和114×的測序覆蓋度。采用Newbler v2.8和CLC Genomics Workbench對測序reads進(jìn)行拼接后得到S.suis 05HAS68的全基因組序列長度為2,176,073 bp。通過RAST在線注釋和比對BLAST、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫對S.suis05HAS68進(jìn)行全基因組注釋。利用DNAStar軟件包、CGView Server、t RNAScan-SE 1.21和RNAmmer 1.2,分析S.suis 05HAS68基因組的一般特性。注釋及分析結(jié)果顯示,S.suis 05HAS68基因組的GC含量為41.2%,共編碼2009個基因,另外還編碼56個t RNA基因和12個r RNA基因。3.2型豬鏈球菌05HAS68與有毒株的比較基因組學(xué)分析:采用比對毒力因子數(shù)據(jù)庫和BLASTp比對的方法,鑒定S.suis 05HAS68基因組上存在的VAF和TCSTS。通過Island Viewer、CRISPRfinder和Prophage Finder鑒定S.suis 05HAS68基因組上可能的基因組島、CRISPR結(jié)構(gòu)和前噬菌體結(jié)構(gòu)。利用ACT和Mauve軟件分析S.suis05HAS68與其他豬鏈球菌基因組大規(guī)模重排的方式和規(guī)律。我們發(fā)現(xiàn)S.suis 05HAS68與S.suis 05ZYH33和S.suis 98HAH12共有1751個基因,但是S.suis 05HAS68特有253個基因。其中包括1個CRISPR結(jié)構(gòu)、4個前噬菌體結(jié)構(gòu)和1個113K代謝島(半乳糖代謝途徑和巖藻糖代謝途徑)。S.suis 05HAS68基因組中缺少重要的VAF,例如SLY、MRP、EPF和毒力相關(guān)蛋白E等,Sal K/Sal R、Nis K/Nis R、Vir R/Vir S和Rev S等毒力相關(guān)的TCSTS在S.suis 05HAS68基因組中也是缺失的。S.suis 05HAS68基因組與其他豬鏈球菌基因組之間存在由轉(zhuǎn)座酶和前噬菌體介導(dǎo)的大規(guī)模基因組重排,且重排圍繞基因組的復(fù)制軸(ori/ter axis)呈“X形”。4.89K PAI在S.suis各菌株中的分布情況及S.suis的系統(tǒng)發(fā)生分析:比對89K PAI序列在豬鏈球菌以及其他鏈球菌中的分布情況。在豬鏈球菌P1/7、A7、GZ1、S735、ST1和ST3菌株中沒有比對到89K PAI的同源序列,在豬鏈球菌SC84和BM407中比對到了絕大部分的89K PAI同源序列,其他豬鏈球菌中則比對到了一部分89K PAI同源片段,另外在無乳鏈球菌和肺炎鏈球菌中也比對到了部分89K PAI的同源序列。綜合評價用rpo B、16S r RNA、ITS(internal transcribed spacer)和core gene構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹,可以看出S.suis 05HAS68在進(jìn)化關(guān)系上與高致病性2型豬鏈球菌相距較遠(yuǎn)。5.2型豬鏈球菌05HAS68的毒力鑒定及免疫保護(hù)初探討:用同等劑量(1×108 CFU)的S.suis 05HAS68、高致病性菌株05ZYH33和98HAH12分別攻擊仔豬。攻毒實(shí)驗證明,S.suis 05HAS68對動物不具有致死性。分別用無毒株05HAS68和基因敲除改造的無毒株Δsal KR免疫仔豬2次后,再用高致病性菌株05ZYH33或98HAH12進(jìn)行攻擊,觀察無毒株05HAS68對仔豬是否具有免疫保護(hù)作用。實(shí)驗結(jié)果顯示,事先用無毒株05HAS68免疫的動物可免受高致病性菌株的攻擊,但是用基因敲除改造的無毒株Δsal KR免疫的仔豬,不能抵抗高致病性菌株05ZYH33的攻擊,初步說明S.suis05HAS68對仔豬具有免疫保護(hù)效果。綜上所述,本研究成功的鑒定了一株無毒的2型豬鏈球菌05HAS68,并對其進(jìn)行全基因組測序和比較基因組學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn),S.suis 05HAS68與高致病性豬鏈球菌之間存在較大的毒力差異,且基因組間存在大規(guī)模重排,可能是由轉(zhuǎn)座酶和/或前噬菌體介導(dǎo)的。該無毒株有望成為預(yù)防豬鏈球菌病的疫苗候選株。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.611

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本文編號：2732518