【摘要】：禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬,與禽類多種腫瘤性疾病及生產(chǎn)性能息息相關(guān)。該病毒主要引起禽類產(chǎn)生腫瘤以及慢性消耗性死亡,造成免疫抑制及生長(zhǎng)遲緩,產(chǎn)蛋率大幅度下降,給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失。ALV通過垂直和水平兩種方式傳播,限制本病的主要方法是淘汰陽性雞,凈化種群中的ALV-A、B、C、D、J和K等亞群。不同亞群病毒有不同的生物學(xué)特性以及臨床癥狀,臨床上選擇合適的試劑盒是凈化該病毒的關(guān)鍵。本研究通過研制針對(duì)A亞群禽白血病病毒gp85的單克隆抗體,并分析不同試劑盒檢測(cè)禽白血病的差異性,為生產(chǎn)實(shí)踐中禽白血病的凈化提供研究基礎(chǔ)。1 抗A亞群禽白血病病毒單克隆抗體的制備與鑒定Gp85是ALV的囊膜蛋白,由ALV基因組中env基因編碼,具有亞群特異性。本研究首先設(shè)計(jì)出一對(duì)針對(duì)A亞群禽白血病病毒env基因的特異性引物,PCR擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)室分離保存的ALV-A-AH10毒株的gp85基因,然后構(gòu)建原核表達(dá)載體PET32a-AH10-gp85,通過轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性轉(zhuǎn)化質(zhì)粒并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲波破碎,取離心后的上清和沉淀分別作SDS-PAGE分析,結(jié)果獲得大小約53KD的目的蛋白。純化后的PET32a-AH10-gp85蛋白與適量佐劑乳化后免疫6-8周齡BALB/c雌性小鼠,三次免疫后測(cè)小鼠血清抗體效價(jià),對(duì)免疫效果較好的加強(qiáng)免疫,三天后取脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。用感染AH10病毒的DF1細(xì)胞板,固定后,對(duì)融合成功的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行IFA篩選。陽性孔經(jīng)過2-3次亞克隆,結(jié)果獲得五株穩(wěn)定分泌單克隆抗體,分別命名為ALV-A-1B12、ALV-A-1C12、ALV-A-1E5、ALV-A-1F8 和 ALV-A-3D11。Western-blot 和 IFA試驗(yàn)結(jié)果表明,所獲單抗3D11只針對(duì)ALV-A/B囊膜蛋白gp85抗原,而其余四株可與J亞群病毒發(fā)生熒光反應(yīng)。本次研究成功制備出一株針對(duì)ALV-A/B的單克隆抗體(3D11),為快速篩檢田間感染A/B亞群禽白血病病毒的雞群提供了臨床診斷試劑。2不同試劑盒檢測(cè)禽白血病肛拭陽性率的差異性分析建立快捷準(zhǔn)確,成本低,可用于大批量田間試驗(yàn)的診斷技術(shù)是防制禽白血病的重要一環(huán)。ELISA檢測(cè)方法因其具有靈敏、快捷、適用于大面積檢測(cè)等特點(diǎn),在眾多方法中脫穎而出,被廣泛應(yīng)用于禽白血病的種群凈化中。為探索不同ELISA試劑盒針對(duì)禽白血病p27抗原檢測(cè)靈敏度的差異性,本研究將60只2周齡黃羽雛雞(包括30只活雞、30只死雞)進(jìn)行編號(hào)并采集肛拭、血樣及組織樣本。分別用IDEXX公司p27抗原檢測(cè)試劑盒和sELISA試劑盒檢測(cè)其肛拭樣本。血樣及組織樣本接種DF1細(xì)胞分離病毒,7天后取培養(yǎng)上清進(jìn)行p27抗原檢測(cè)及鑒定,分析比較肛拭陽性率差異,并通過PCR、RT-PCR及間接免疫熒光法驗(yàn)證。結(jié)果顯示,sELISA試劑盒肛拭陽性檢出率為68%,IDEXX試劑盒陽性檢出率為27%,且IDEXX公司陽性檢出樣本均存在于sELISA試劑盒陽性檢出的樣本中。陽性差異樣本通過測(cè)序分析,進(jìn)一步確認(rèn)為感染K亞群禽白血病病毒,這一結(jié)果顯示,sELISA試劑盒能夠更靈敏有效地檢測(cè)陽性肛拭樣本,特別是檢測(cè)肛拭中的禽白血病K亞群病毒。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

圖１－１邋ＰＥＴ３２ａ－ｃ邋（邋＋邋）載體結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋ＰＥＴ３２ａ－ｃ邋（＋）邋ｃａｒｒｉｅｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑

３．１目的基因的擴(kuò)增逡逑利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增ＡＨ１０－ｇｐ８５基因，經(jīng)過１％瓊脂糖凝膠電泳，得逡逑到一條１０１７ｂｐ大小的清晰條帶（圖１－１），與預(yù)期ＤＮＡ片段大小相符。逡逑Ｍ邋１逡逑ｌｋｂ邋—？邋＾—邋１０１７ｂｐ逡逑圖１－１目的基因的擴(kuò)增逡逑Ｍ：邋１邋ｋｂ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ逡逑ｌ：ＡＨ１０－ｇｐ８５基因ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：邋ｌｋｂ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ逡逑１：ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＨ１０－ｇｐ８５邋ｇｅｎｅ逡逑３．２重組質(zhì)粒ＰＥＴ３２ａ－ＡＨ１０－ｇｐ８５的雙酶切鑒定逡逑測(cè)序正確的ｐＧＥＭ－Ｔ－ｇｐ８５與表達(dá)載體質(zhì)粒ＰＥＴ－３２ａ分別用ＢａｍＨＩ和Ｋｐｎｌ雙酶切處理逡逑后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ＢＬ２１，利用試劑盒提取重組質(zhì)粒，再通過ＢａｍＨＩ和Ｋｐｎｌ進(jìn)行逡逑雙酶切鑒定，可以看到酶切產(chǎn)物出現(xiàn)一條大小為１０１７ｂｐ的目的條帶和一條大小約５９００ｂｐ逡逑

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