【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的各種家畜及野生動物以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性傳染病。該病自1947年傳入我國,通過疫苗免疫疫情基本呈穩(wěn)定狀態(tài)。2011年以后,以HeN1株為代表的變異株在全國多個地區(qū)爆發(fā)流行,原有疫苗不能對豬群提供完全保護,這對偽狂犬病的監(jiān)控及病原結構的研究提出了新的要求。豬偽狂犬病毒gB糖蛋白具有很好得保守性,通過檢測gB蛋白可以反映豬群的抗體水平。本實驗目的是制備抗PRV gB蛋白的單克隆抗體并鑒定其抗原表位。以超離純化的PRV HeN1株全病毒為抗原免疫6周齡BALB/c小鼠,取免疫后血清抗體呈陽性的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合,用免疫熒光的方法(IFA)篩選陽性雜交瘤細胞,經過4次亞克隆獲得一株穩(wěn)定分泌抗PRV gB蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株1E7。Western blot結果表明,1E7細胞分泌的單克隆抗體與PRV全病毒和真核表達的gB蛋白均能反應�？贵w亞類鑒定1E7細胞分泌的單抗重鏈屬于IgG2b亞類,輕鏈為kappa鏈。ELISA試驗顯示1E7細胞分泌的單抗與PRV的結合可以被豬陽性血清阻斷。雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和制備的腹水中抗體的IFA效價分別為1:160和1:12800。利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng),表達一系列gB截短蛋白,最終確定1E7細胞分泌的單抗識別的抗原表位是S~(81)AEESLE~(87),且此表位在各PRV毒株間相對保守。本單克隆抗體的成功制備為PRV抗體檢測方法的建立及gB蛋白的結構和功能研究提供了實驗材料。
【學位授予單位】：黑龍江八一農墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651
【圖文】：

犬病病毒 HeN1 株 gB 蛋白單克隆抗體制5-20 min，加入 2M H2SO4，50 μL/孔純化后的 PRV HeN1 蛋白濃度為 2 Vero 細胞培養(yǎng)上清 100 倍稀釋后N1 gE單克隆抗體和兔抗鼠紅外熒光 PRV HeN1 為抗原的泳道，在 120V HeN1 病毒能被 PRV HeN1 病毒 M 1 2kDa

2.3.3 雜交瘤細胞株的篩選對上述血清抗體含量高的小鼠進行加強免疫，三天后取加強免疫后的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0 以 PEG 為融合劑對兩種細胞進行融合，融合后 14 d 時，細胞長滿底部的 1/4，以感染了 PRV HeN1 病毒的 Vero 細胞為抗原經 IFA 方法對細胞培養(yǎng)上清進行第一次篩選，將篩選出的陽性雜交瘤細胞繼續(xù)用轉染了 PCDNA3.1(+) PRV HeN1 gB 質粒的293T 細胞為抗原經 IFA 方法進行第二次篩選，將兩次鑒定均為陽性的細胞進行有限稀釋法即亞克隆，經過 4 次亞克隆，最終獲得一株穩(wěn)定分泌抗 PRV HeN1 gB 蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，將其命名為 IE7，1E7 分泌的單克隆抗體可以特異性識別 PRV HeN1，PRV HeN1gB，如圖 2.3。圖 2.2 免疫后小鼠血清的 IFA 分析（200×）A-F：免疫后小鼠血清 G：未免疫小鼠血清Fig 2.2 IFAanalysis of mouse serum after immunization（200×）A-F: mouse serum after immunization G: mouse serum without immunization

【參考文獻】

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本文編號：2720168