【摘要】：單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種胞內(nèi)致病菌,主要感染免疫功能低下的個(gè)體,可致敗血癥、腦膜炎、胎兒感染或流產(chǎn)等。寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Oligeopeptide transporter,Opp)是寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中運(yùn)送胞內(nèi)生長(zhǎng)所必需的氨基酸及調(diào)控細(xì)菌毒力的一類(lèi)蛋白質(zhì)。在基于利用泛基因組技術(shù)對(duì)LM的研究中,首次發(fā)現(xiàn)lmo2193基因具有Opp活性,但其具體功能尚未知。本研究以新疆綿羊腦炎臨床分離株LM90SB2為研究材料,對(duì)lmo2193基因進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)后通過(guò)重疊延伸PCR與同源重組技術(shù)構(gòu)建lmo2193基因缺失株及回補(bǔ)株,并將缺失株分別與野毒株、回補(bǔ)株進(jìn)行比較,分析其環(huán)境適應(yīng)性、生物被膜形成能力、細(xì)胞粘附侵襲性、胞內(nèi)增殖毒力影響等探究lmo2193基因作為Opp在LM中的功能及其對(duì)致病性的影響。目的:(1)生物信息學(xué)分析推測(cè)LM90SB2菌株lmo2193基因功能。(2)構(gòu)建該基因的缺失株及回補(bǔ)株。(3)研究該基因缺失對(duì)LM環(huán)境適應(yīng)性及生物被膜形成能力的影響。(4)研究該基因缺失對(duì)LM毒力的影響。方法:(1)PCR擴(kuò)增lmo2193基因,克隆測(cè)序,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并表達(dá)該蛋白,用SDS-PAGE凝膠電泳與Western Blot技術(shù)鑒定。(2)PCR擴(kuò)增上下游臂,利用重疊延伸PCR擴(kuò)增融合片段,與穿梭質(zhì)粒pKSV7連接,電轉(zhuǎn)至野毒株感受態(tài)中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,雙重壓力傳代培養(yǎng)篩選基因缺失株;將該基因與整合型質(zhì)粒pIMK2連接,電轉(zhuǎn)至缺失株感受態(tài)中篩選基因回補(bǔ)株;檢測(cè)遺傳穩(wěn)定性。(3)在不同環(huán)境壓力條件下對(duì)缺失株與野毒株、回補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線及不同時(shí)間段生物被膜形成進(jìn)行比較。(4)分別利用缺失株、野毒株、回補(bǔ)株感染不同來(lái)源的細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞粘附、侵襲性及胞內(nèi)增殖能力進(jìn)行比較;感染小鼠,檢測(cè)LD_(50)及比較肝臟、脾臟、腦組織載菌量的差異。結(jié)果:(1)生物信息學(xué)分析顯示:lmo2193蛋白為ATP超家族,推定該基因?yàn)閛ppD;原核表達(dá)該基因,獲得60 kDa左右的融合蛋白,與預(yù)期一致。(2)成功構(gòu)建了具有良好穩(wěn)定遺傳性的缺失株LM90SB2ΔoppD及回補(bǔ)株CLM90SB2ΔoppD。(3)在不同溫度、EtOH濃度、pH、NaCl濃度條件下LM90SB2ΔoppD比LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD生長(zhǎng)緩慢;LM90SB2ΔoppD的網(wǎng)格密集程度與生物被膜形成量均低于LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD。(4)LM90SB2ΔoppD對(duì)四種細(xì)胞的粘附及侵襲率相比LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD均有所下降;在SIEC細(xì)胞內(nèi),三株細(xì)菌增殖量均逐漸減少,而在RAW264.7、MBMEC和HBMEC,菌量均呈逐漸增多趨勢(shì);小鼠實(shí)驗(yàn)中,LM90SB2ΔoppD的毒力水平較LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD分別提高了1.34、0.5個(gè)數(shù)量級(jí);LM90SB2ΔoppD在各組織載菌量均低于LM90SB2與CLM90SB2ΔoppD。結(jié)論:(1)推定LM90SB2菌株lmo2193基因功能為OppD。(2)成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳性的缺失株LM90SB2ΔoppD及回補(bǔ)株CLM90SB2ΔoppD。(3)LM90SB2菌株lmo2193基因的缺失會(huì)使其環(huán)境適應(yīng)性及生物被膜形成能力降低。(4)LM90SB2菌株lmo2193基因缺失會(huì)使其毒力下降。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【圖文】：

Opp基本結(jié)構(gòu)示意圖（A）及操縱子（B）示意圖（引自張偉欣）

1-1 lmo2193 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果CR amplification results of lmo2193 gene DNAMarKer；1：lmo2193 基因 PCR 擴(kuò)果；2：hly 基因鑒定；3-4：空白000 DNAMarKer; 1: PCR products of3 gene; 2: Identification of hly gene; 3-4:圖 1-2 pMT19T-2193 重組質(zhì)粒Fig.1-2 Identification of recompMD19T-2193 by enzymM: 2 000 DNAMarKer；1：pM切產(chǎn)物； 2：pMD19M: 2 000 DNAMarKer; 1: pM

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本文編號(hào)：2718986