發(fā)布時間：2020-06-17 15:02

【摘要】：端粒酶逆轉錄酶基因(TERT)編碼的蛋白是組成端粒酶的三個主要成分之一,是端粒酶活性的限速單位。端粒酶通過在端粒末端補充“TTAGGG”重復序列阻止細胞復制性衰老。本研究檢測了鴨TERT(dTERT),相對端粒酶活性(RTA)和相對端粒長度(RTL)在鴨早期發(fā)育階段的時空分布特點�？寺×锁員ERT 5'-側翼序列,研究了表觀遺傳特別是DNA甲基化對dTERT表達的調控作用。最后,基于雙熒光素酶活性檢測和生物信息學分析,選擇靠近轉錄起始位點的近端調控區(qū)作為靶序列,利用CRISPR-Cas9技術內源性激活了鴨小腸上皮細胞中的TERT。結果如下:1.鴨TERTmRNA,相對端粒酶活性(RTA)和相對端粒長度(RTL)的時空分布特點在出生后7天雛鴨的所有8個測試組織(心臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸、腿肌、性腺和胰腺)中均檢測到了TERTmRNA的表達。其中,TERT在小腸和腎臟中的表達水平最高,其次依次是心臟、腿肌、脾臟、胰腺,在性腺和肝臟中的表達水平最低。在肝臟發(fā)育過程中,dTERT的表達趨勢先從E13(胚胎期13天)到E19增加,然后從E19到E26急劇下降,并在D7(出生后7天)達到最低水平。而在腿肌中,dTERT的表達水平從E13到E19變化不大,從E19到E26顯著增加,從E26到D7明顯減少。在所有測試的雛鴨(D7)組織中均檢測到了相對端粒酶活性(RTA),其中小腸中的端粒酶活性特別高,腎臟、心臟和胰腺中的端粒酶活性相對較低,端粒酶活性表現最低的是肝臟和腿肌。隨著胚胎的發(fā)育,肝臟和腿肌中的RTA水平均顯著下降。此外,雛鴨(D7)腿肌中的相對端粒長度(RTL)最長,其次是腎臟、小腸、肝臟、心臟和胰腺。從胚胎發(fā)育到出生階段,肝臟中的RTL從E13到E26相對穩(wěn)定,到D7時明顯縮短。在腿肌中,RTL從E13到E26有小幅度的增加,而到D7時也顯著縮短。2.鴨TERT 5’-側翼序列的克隆及DNA甲基化調控研究克隆獲得了2,413bp長的dTERT 5'-側翼序列,并提交給GenBank(GenBank No.MH910094)。5'-RACE將轉錄起始位點定位到了-93bp處,定義為新的轉錄起始位點(+1)。生物信息學分析顯示,鴨TERT5'調控區(qū)有三個CpG島(S1,S2和S3)。亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)結果表明,與小腸(D7)或肝臟(E19)相比,dTERTmRNA表達量顯著較低的肝臟(D7)在S1區(qū)具有更高的甲基化水平。熒光定量PCR結果顯示,DNA甲基轉移酶DNMT1表達水平在肝臟(D7)中顯著高于其他兩個組織。體外細胞實驗表明,經過甲基轉移酶抑制劑5-aza-2'-deoxycytidine(5-aza-dC)處理后,鴨胚成纖維細胞(DEFs)和小腸上皮細胞(DIECs)中dTERT表達均顯著增加,同時S1區(qū)的甲基化水平顯著降低,上述實驗進一步證明了dTERT受到DNA甲基化的表觀遺傳調控。此外,用組蛋白去乙�；敢种苿﹖richostatinA(TSA)處理DEFs和DIECs后,也導致dTERT表達顯著增加,提示組蛋白乙�；部赡軈⑴c鴨TERT的轉錄調控。3.利用CRISPR-Cas9技術內源性激活鴨TERT雙熒光素酶實驗表明轉錄起始位點(+1)上游541bp是鴨TERT的核心啟動子區(qū),結合潛在轉錄因子位點的生物信息學分析,將-370/-150作為CRISPR/Cas9基因編輯的靶序列。用慢病毒法將10種Cas9-sgRNAs混合質粒轉染DIECs后繼續(xù)培養(yǎng)細胞,當培養(yǎng)到編輯后第5代時(CRISPR 5P)鴨TERT的表達有輕微上調。隨著傳代的進行,dTERT轉錄逐漸增強,直到在CRISPR13P時維持一個穩(wěn)定的水平。當未編輯的DIECs進入衰老停滯時,CRISPR編輯的DIECs依然具有良好的細胞形態(tài)和增殖活性。Sanger測序顯示,CRISPR 5P DIECs中所有sgRNAs都成功整合進鴨基因組,靶區(qū)域呈現出不同形式的基因突變。當培養(yǎng)到編輯后18代時,存活的CRISPR 18PDIECs中的優(yōu)勢突變是靶序列上74bp的缺失,而優(yōu)勢sgRNAs是sgRNAs2,sgRNAs7和sgRNAs9。檢測RTA和RTL發(fā)現,CRIPSR編輯的DIECs中RTA被成功激活,但是并沒有阻止端粒的縮短。熒光定量TERT潛在的靶基因表明,dTERT可能以一種端粒非依賴方式通過抑制衰老凋亡相關基因來維持細胞生長。最后,用LPS和poly(I:C)處理表明,CRISPR編輯的TERT被成功激活的鴨小腸上皮細胞依然具有正常的免疫反應功能。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S834
【圖文】：

領域做出開拓性工作的很多年后，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，邋Ｇｒｅｉｄｅｒ和Ｓｚｏｓｔａｋ分享了諾貝爾生逡逑理學或醫(yī)學獎（Ａｂｂｏｔｔ，２００９）。從開始研宄端粒至今，端粒和端粒酶領域發(fā)表了很逡逑多突破性工作，羅列在圖１．１中。逡逑．Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ邐Ｔｅｔｏｍｅｒａｓｅ逡逑Ｍｕｌｌｅｒ邋－邋ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｅｌｏｍｅｒｅ４７逡逑ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ：邋ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ邋ａｒｅ邋ｎａｔｕｒａｌ邋ｅｎｄｓ，，，Ｓ４＇邋■逡逑Ｈａｙｆｌｉｃｋ邋ｌｉｍｉｔ：邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ邋ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ＊？逡逑Ｗａｔｓｏｎ：邋ｔｅｌｏｍｅｒｅ邋ｅｎｄ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｂｌｅｍ＇＇逡逑，邐．．．邐＞ｖ＇ＩＨ邐Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｔｅｌｏｍｅｒｅ邋ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，＇逡逑0邐Ｈｕｍａｎ邋ｔｅｌ0ｆＷｒ？邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ－逡逑Ｔｅｌｏｍｅｒｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｙｅａｓｔ＊＇＇逡逑Ｔｅ．ｏ．ｅｒａ．ｅ．ｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＨｅＬａｃｅＵ＾逡逑Ｔｅｌｏｍｅｒｅ邋ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｈｕｍａｎ邋ｃｅｌｌｓ－

Ｃ的滯后鏈和一條富含Ｇ的前導鏈。端粒一般通過兩種方式避免線性端被識別為需要修復的ＤＮＡ損傷信號。一是將前導鏈３’端突出的單ＧＧ）ｎ重復序列插入到雙鏈（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ重復序列中去，形成－個類似套，稱為端粒環(huán)（或簡稱為ｔ－環(huán)），這樣染色體就不存在游離的末端（Ｇｒｉｆｆｉｔ１９９９）：二是與蛋白質復合物“Ｓｈｅｌｔｅｒｉｎ’’相結合，使ｔ－環(huán)更加穩(wěn)固（Ｄｅ邋Ｌａｎｇｅ�！埃樱瑁澹欤簦澹颍椋睢睆秃衔镉桑斗N蛋白組成：端粒重復結合因子１邋（ＴＲＦ１），端合因子２邋（ＴＲＦ２），ＴＲＦ２互作蛋白（ＲＡＰ１），ＴＲＦ１互作核因子２邋（ＴＩＮ２）皮質發(fā)育不良蛋白同源物（ＡＣＤ，也稱為ＴＰＰ１，ＰＩＰ１或ＰＴＯＰ）和端粒１邋（ＰＯＴ１邋）。ＴＲＦ１和ＴＲＦ２都與端粒雙鏈序列結合，并且都與ＴＩＮ２蛋其中ＴＲＦ２還與ＲＡＰ１蛋白互作。ＰＯＴＩ與單鏈ＴＴＡＧＧＧ重復序列結合，逡逑結合配偶體ＡＣＤ與ＴＲＦ１，邋ＴＲＦ２相互作用，其中ＡＣＤ與ＴＩＮ２結合（Ｂａｕｍａｎｎ邋ａｎｄ邋Ｃｅｃｈ，邋２００１；邋Ｂｉａｎｃｈｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９７；邋Ｂｉｌａｕｄ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９７；邋Ｚｈｏｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張臥;周榮t

本文編號：2717779