【摘要】：動(dòng)物源性成分是一類來源于動(dòng)物具有種屬代表性的物質(zhì),可以是核酸、蛋白,也可以是各種脂類和小分子物質(zhì)等。近年來,各種畜產(chǎn)品的摻假摻雜事件層出不窮,歐洲 馬肉風(fēng)波‖、中國(guó) 假羊肉事件‖等肉類摻假事件,飼料中非法添加反芻動(dòng)物成分引起的瘋牛病全球性傳播等,這些畜產(chǎn)品安全問題嚴(yán)重影響肉類市場(chǎng)秩序和畜牧業(yè)的健康發(fā)展。對(duì)食品和飼料中動(dòng)物源性成分的定性、定量檢測(cè)是解決這一問題的重要技術(shù)手段。目前主要的檢測(cè)方法是基于線粒體DNA(mtDNA)的PCR方法。然而,由于mtDNA在組織和個(gè)體間的拷貝數(shù)差異和堿基高變異性,使其易出現(xiàn)假陰性檢測(cè)結(jié)果,且難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量,因而迫切需要篩選新的物種特異性的DNA序列。此外,肉類摻假檢測(cè)中多物種通用內(nèi)參的缺乏或保守性差等問題也影響畜產(chǎn)品定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究利用動(dòng)物全基因組序列和轉(zhuǎn)錄組信息,通過比較基因組學(xué)分析策略分別篩選物種特異性核DNA序列和多物種保守的核DNA序列,建立肉和飼料中多種動(dòng)物源性成分的定性、定量檢測(cè)方法。為滿足畜產(chǎn)品安全監(jiān)管部門對(duì)動(dòng)物源性成分鑒別的系統(tǒng)化、多元化、快速化的迫切需求提供技術(shù)支撐。取得的主要結(jié)果如下:1.物種特異性DNA序列的篩選及其分子特征分析為了獲得新的物種特異性DNA序列,本研究基于物種的全外顯子序列,以獨(dú)創(chuàng)的動(dòng)態(tài)E-value結(jié)合Identity%、Quary-cover%為篩選條件,通過與Nt數(shù)據(jù)庫(kù)、非目標(biāo)物種基因組和目標(biāo)物種基因組的3次本地BLASTN序列比對(duì)分析,根據(jù)物種的分類地位,在11個(gè)科的19個(gè)物種中篩選各物種特異性外顯子。隨后,將各物種的特異性外顯子分為完全特異的外顯子序列(CESS)和部分特異的外顯子序列(PESS),并對(duì)其進(jìn)行分布、結(jié)構(gòu)和序列特征的分析發(fā)現(xiàn):物種的特異性外顯子占物種總外顯子的比例很低,且與染色體的大小無關(guān)。其中的CESS主要分布在CDS區(qū),且序列內(nèi)部含有大量重復(fù)元件;長(zhǎng)度較短的、高GC含量的外顯子更易發(fā)生片段的完全缺失或增加,且其形成與序列上下游的同向重復(fù)序列以及序列內(nèi)部的短重復(fù)序列有關(guān)。進(jìn)一步利用各物種特異性DNA序列設(shè)計(jì)引物,并在19個(gè)物種中進(jìn)行PCR檢測(cè),驗(yàn)證了序列和引物的物種特異性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明篩選的物種特異性DNA序列可作為種源成分檢測(cè)的靶標(biāo)。2.基于物種特異性DNA序列建立肉制品及動(dòng)物源性飼料中種源成分的定性PCR檢測(cè)方法為了解決種源檢測(cè)中靶序列單一匱乏、特異性和保守性差等問題,基于篩選獲得的物種特異性DNA序列,建立了肉制品中牛、羊、豬、雞和鴨源性成分的定性PCR檢測(cè)方法。通過在線BLAST和ClustalW多序列比對(duì)分析,將物種特異性DNA序列分別與包含動(dòng)物、植物和微生物在內(nèi)的4個(gè)界、11個(gè)綱、21個(gè)目、36個(gè)科、47個(gè)屬的53個(gè)代表性物種的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)各序列均具有高度的種間特異性和種內(nèi)保守性。通過物種特異性引物設(shè)計(jì)并進(jìn)行反應(yīng)體系、反應(yīng)條件優(yōu)化,建立了5個(gè)物種5對(duì)引物相同反應(yīng)程序(退火溫度均為60℃)的PCR檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)了肉中牛、羊、豬、雞、鴨成分的同時(shí)檢測(cè)。所建立的PCR檢測(cè)方法在19個(gè)物種中進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明5個(gè)物種的種源檢測(cè)PCR方法具有高度的物種特異性,僅在目標(biāo)物種中具有擴(kuò)增產(chǎn)物,其他物種中無任何產(chǎn)物;同時(shí)利用5個(gè)物種的44個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增都得到預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物,通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,在同一物種中的序列具有一致性,說明這些物種特異性序列在物種內(nèi)具有高度的保守性。所建立的PCR檢測(cè)方法,靈敏度均可達(dá)到0.5ng。進(jìn)一步對(duì)牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉的熟肉制品進(jìn)行檢測(cè),得到與產(chǎn)品種源成分一致的檢測(cè)結(jié)果,說明本方法可用于加工肉食中種源成分的檢測(cè)。針對(duì)瘋牛病的飼料源性傳播問題,篩選了�？铺禺愋曰騎AF4,該基因在牛和羊中存在18bp片段差異,針對(duì)該差異片段設(shè)計(jì)一對(duì)牛羊通用引物,但擴(kuò)增產(chǎn)物大小不同,通過一次PCR反應(yīng)即可同時(shí)檢測(cè)和鑒別牛(125bp)、羊(107bp)源性成分,并在23個(gè)物種中表現(xiàn)出高度的物種特異性。對(duì)牛(黃牛、牦牛、瘤牛、水牛)、羊(綿羊、山羊)不同品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序比對(duì)分析,結(jié)果表明該序列在牛、羊中都分別具有高度保守性。所建立的PCR檢測(cè)方法,靈敏度可達(dá)到0.2ng DNA。最后,對(duì)5份委托制作的動(dòng)物源性飼料的檢測(cè)結(jié)果說明該方法具有檢測(cè)飼料樣品中牛、羊源性成分的能力,具有重要的應(yīng)用價(jià)值。3.篩選哺乳動(dòng)物和鳥類中高度保守的單拷貝序列作為多物種通用內(nèi)參并建立定量檢測(cè)方法定量檢測(cè)是對(duì)畜產(chǎn)品摻假情況進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估的一個(gè)重要方法。而可靠有效的定量?jī)?nèi)參是解決這一問題的前提。本文從全基因組水平出發(fā),利用11個(gè)科的13個(gè)哺乳動(dòng)物和鳥類物種的外顯子數(shù)據(jù),通過比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法篩選了在哺乳動(dòng)物和鳥類中同源率95%的高度保守的核DNA序列,并在保守區(qū)設(shè)計(jì)了多物種通用引物。通過在18個(gè)動(dòng)物物種基因組中試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),該序列具有高度保守性、且為單拷貝序列。基于多物種定量?jī)?nèi)參,進(jìn)一步建立和優(yōu)化了一種種源成分定量檢測(cè)方法,相對(duì)誤差(R.E.)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(R.S.D.)均小于25%。并通過引入基因組當(dāng)量(GE)和校正系數(shù)k的概念,實(shí)現(xiàn)了DNA混合樣品中牛、兔、狗、狐、貂成分的更加精準(zhǔn)的定量檢測(cè)。為畜產(chǎn)品中種源成分的準(zhǔn)確定量提供了可靠的多物種通用的定量?jī)?nèi)參和檢測(cè)方法。4.基于多物種通用內(nèi)參建立肉制品中多種動(dòng)物源性成分的多重定量檢測(cè)方法針對(duì)歐洲 馬肉風(fēng)波‖問題,結(jié)合牛、馬的特異性DNA序列和多物種通用內(nèi)參,建立了牛(223bp)、馬(197bp)和動(dòng)物(129bp)源性成分的三重定性和定量檢測(cè)方法;針對(duì)我國(guó) 假羊肉事件‖,結(jié)合羊、狐、鼠的特異性DNA序列和多物種通用內(nèi)參,建立了羊(237bp)、狐(211bp)、鼠(160bp)源性成分的多重定性和定量檢測(cè)方法。所有物種特異性序列均與包含動(dòng)物、植物、微生物在內(nèi)的53個(gè)物種的參考基因組進(jìn)行BLAST和ClustalW序列比對(duì),并在堿基差異區(qū)設(shè)計(jì)物種特異性引物和探針。利用普通PCR和TaqMan熒光PCR在多個(gè)物種DNA中對(duì)序列、引物和探針的特異性進(jìn)行驗(yàn)證,并進(jìn)而驗(yàn)證了各物種特異性序列均為固定拷貝數(shù)的序列。多重PCR體系的建立說明各組引物和探針之間不存在交叉互作,確保了單一體系中多種種源成分的同時(shí)檢測(cè)和定量。保守性試驗(yàn)表明各物種特異性序列和引物在各自目標(biāo)物種內(nèi)的高度保守性。靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明檢出限(LOD)為0.05ng DNA,定量限(LOQ)達(dá)5%。并通過構(gòu)建各物種特異性序列和內(nèi)參序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立了GE與Ct值的計(jì)算關(guān)系,對(duì)多組DNA混合樣品和不同質(zhì)量比的混合肉樣品進(jìn)行多重定量檢測(cè),R.E.和R.S.D.均小于25%,表明所建立的多重定量檢測(cè)方法的具有良好的檢測(cè)準(zhǔn)確度和精確度。本研究利用比較基因組學(xué)方法篩選物種特異性核DNA序列用于種源成分檢測(cè);篩選保守性核DNA序列作為多物種定量?jī)?nèi)參。進(jìn)而建立了肉和飼料中牛、羊、豬、馬、雞、鴨、狐等多種種源成分的定性和定量檢測(cè)方法,為種源成分檢測(cè)提供了相應(yīng)的方法和候選素材,為食品和飼料安全提供重要的技術(shù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S816.17;TS251.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2713491