【摘要】：禽白血病(Avian leukosis,AL)是一種由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的雞的以垂直傳播為主的腫瘤性傳染病,目前在世界上廣泛分布。隨著科學(xué)家不斷的研究和探索,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)A、B、C、D和J亞群5種外源性的白血病病毒,以及E、F、G、H和I亞群5種內(nèi)源性病毒。在雞群中可分離到的ALV分別屬于A、B、C、D、E和J6個(gè)亞群,近年研究者認(rèn)為我國(guó)雞群中存在K亞群ALV�？偨Y(jié)以往的研究發(fā)現(xiàn),A亞群、B亞群和J亞群是現(xiàn)場(chǎng)流行最廣的ALV亞群。本實(shí)驗(yàn)室于2017年從疑似患有AL的河田雞中分離并鑒定了自然重組毒株ALV-FJ15HT0,該毒株具有ALV-B特異性gp85基因序列、ALV-Egp37序列和ALV-JLTR序列。為研究該毒株的分子特性及致病特性,本研究通過(guò)建立人工感染動(dòng)物模型,模擬垂直傳播,并且通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,進(jìn)一步探究參與重組ALV與宿主細(xì)胞之間互作的基因,并且從蛋白質(zhì)水平上加以分析驗(yàn)證,為進(jìn)一步研究自然重組ALV的致病機(jī)制等提供科學(xué)數(shù)據(jù)。1.感染組雞體重及免疫器官指數(shù)的變化在2d、5d、9d、13d、17d、21d時(shí)稱(chēng)量空白對(duì)照組和垂直感染組雞體重,采集血液、肝臟、脾臟、法氏囊和胸腺,并且稱(chēng)量器官重量,計(jì)算免疫器官指數(shù),使用qRT-PCR在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量gp85在不同組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示,感染組雞胚在孵化后生長(zhǎng)受到顯著性抑制(P0.01),感染組法氏囊器官指數(shù)顯著受抑(P0.05),而感染組和對(duì)照組的脾臟,胸腺和肝臟器官指數(shù)在檢測(cè)的這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)上沒(méi)有顯著差異(P0.05)。隨著日齡的增長(zhǎng),ALV病毒含量隨著日齡的增長(zhǎng)而顯著增加;相關(guān)性分析顯示,包括法氏囊(r=-0.546),脾臟(r=-0.502)和肝臟(r=-0.517)在內(nèi)的感染組織中g(shù)p85基因表達(dá)的變化與相應(yīng)的體重差異之間呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性(P0.05),感染組胸腺組織中g(shù)p85轉(zhuǎn)錄水平變化與相應(yīng)的體重差異之間呈現(xiàn)出極顯著相關(guān)性(r=-0.559,P0.01)。2.自然重組ALV感染SPF雞胸腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析本研究將ALV-FJ15HT0接種到6胚齡(ED)SPF雞胚的卵黃囊中模擬垂直傳播,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。分別于5日齡(d)、13d和21d時(shí)無(wú)菌采集空白對(duì)照組和感染組雞胸腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果顯示,5d時(shí)在兩組動(dòng)物胸腺樣品中檢測(cè)到227個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)、13d檢測(cè)到286個(gè)DEG,21d檢測(cè)到251個(gè)DEG,這些DEG主要涉及細(xì)胞過(guò)程、結(jié)合、生物學(xué)調(diào)節(jié)、代謝加工、刺激反應(yīng)和免疫系統(tǒng)等反應(yīng)。通過(guò)信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn),這些DEG主要涉及的信號(hào)通路有煙酸和煙酰胺代謝、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、脂肪酸降解、PPAR信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、細(xì)胞粘附分子、JAK-STAT信號(hào)通路等。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的部分差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示兩者的檢測(cè)結(jié)果相一致。3.睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)及其受體(CNTFRα)參與病毒宿主互作通過(guò)信號(hào)通路分析,發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的基因即CNTFRα在感染SPF白萊杭雞胸腺中表達(dá)顯著上調(diào),經(jīng)過(guò)對(duì)該基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,在感染雞胸腺中CNTFRα基因表達(dá)在13-21d期間極顯著上調(diào)(P0.01),對(duì)感染雞和對(duì)照雞群血清CNTF滴度進(jìn)行ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)感染雞血清CNTF在17-21d顯著上升(P0.05)。通過(guò)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):感染雞胸腺中CNTFRα基因表達(dá)水平與相應(yīng)的gp85基因表達(dá)水平呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.656,P0.01),進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),感染雞肝臟中CNTFRα基因表達(dá)水平與相應(yīng)的gp85基因表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.525,P0.05),可知CNTF及CNTFRα可能參與重組ALV與宿主之間的互作。通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲得雞CNTFRα蛋白并進(jìn)行純化,濃度達(dá)到0.6 mg/mL。將純化后的蛋白在新西蘭白兔皮下進(jìn)行5次多點(diǎn)注射免疫,使其產(chǎn)生抗體。使用Western Blot技術(shù)對(duì)兔血清抗雞CNTFRα抗體進(jìn)行特異性檢測(cè),結(jié)果顯示,抗體濃度在1:2 000時(shí),抗體結(jié)合率最高且特異性強(qiáng)。以Western Blot鑒定空白對(duì)照組和垂直感染組動(dòng)物胸腺CNTFRα蛋白。結(jié)果顯示,空白對(duì)照組和垂直感染組雞胸腺中CNTFRα蛋白表達(dá)水平均隨著日齡增加而降低,在13-21d時(shí),垂直感染組雞胸腺中CNTFRα蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組(P0.05),這一結(jié)果與CNTFRα轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果相一致。進(jìn)一步證實(shí)CNTFRα參與病毒與機(jī)體的互作。
【圖文】：

合［１５］，啟動(dòng)ＡＬＶ的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。禽白血病病毒的非編碼區(qū)分布在兩端，形成長(zhǎng)末逡逑端序列（Ｌｏｎｇ邋ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｒｅｐｅａｔｓ，邋ＬＴＲ）影響病毒ＲＮＡ的復(fù)制及翻譯；編碼區(qū)則由逡逑核心蛋白、酶蛋白、ＤＮＡ聚合酶和囊膜蛋白４個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成，見(jiàn)圖１－２［１６］。核心逡逑蛋白包含衣殼蛋白ｐ２７是群特異性抗原，是ＡＬＶ亞群分類(lèi)的主要依據(jù)之一。病毒逡逑囊膜糖蛋白包括ｇｐ８５和ｇｐ３７兩種，外膜蛋白ｇｐ８５具有特異性識(shí)別功能，能夠識(shí)別逡逑靶細(xì)胞的特異性病毒受體，也具有亞群特異性，也是ＡＬＶ亞群分類(lèi)的主要依據(jù)之逡逑一，ｇｐ３７為穿膜蛋白（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＴＭ），，負(fù)責(zé)病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞［１７］。病逡逑毒經(jīng)反復(fù)凍融后會(huì)發(fā)生病毒粒子裂解同時(shí)釋放Ｐ２７群特異性抗原［１８］。逡逑５．１．？叫邐｜３觀(guān)逡逑Ｉ邐Ｉ！邐Ｈ—邋ｅ？ｖ邋—逡逑－ｓ－ｉｒｒＲ－４邐ｓ邋叩邐邐ｐ0ｉ邐Ｈ邐ｋｕＴＲ－ｊ逡逑ｌ｜ｌ邋Ｉ邋１｜邋Ｉ邋Ｉ邋ＩＩ＂１丨痛逡逑Ｕ３邋Ｒ邋Ｕ５邋Ｐｌ邋９ｐ２Ｐｌ邋0邋ＰＺ１邋ｐｌ邋２邋Ｐ１５邋ＲＴ邋ＩＮ邋８Ｐ８５邐ＤＲ１邋Ｕ３ＲＵＳ逡逑圖１－２邋ＡＬＶ的基因組結(jié)構(gòu)圖［１６］逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＬＶ逡逑１．３邋ＡＬＶ的分類(lèi)逡逑隨著科學(xué)家不斷的研宄和探索，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｊ亞群５種逡逑外源性禽白血病病毒，以及Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ和Ｉ亞群５種內(nèi)源性禽白血病病毒。目逡逑２逡逑

（ｒ＝－０．５４６），脾臟（ｒ＝－０．５０２）和肝臟（ｒ＝－０．５１７）在內(nèi)的感染組織中ｇｐ８５表達(dá)逡逑的變化與相應(yīng)的體重差異顯著相關(guān)（戶(hù)＜0．0５）。胸腺中ｇｐ８５基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)如逡逑圖２－２ａ所示，感染組胸腺中ｇｐ８５的倍數(shù)變化與體重差異極顯著相關(guān)（ｒ＝－０．５５９，逡逑尸＜０．０１）（圖２－２ｂ）。據(jù)此，選擇胸腺作為用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)的組織。逡逑２４邋邐邋２０邋邐邐邐逡逑＜３）２0邋．邐□邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｇｒｏｕｐ邋１邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋Ｇｒｏｕｐ邋ｊ邐＾邋１０邐0逡逑．２邋１５邐Ｔ邋ｉ邋‘W 邐Ｓ邐￣＾￣３＾０￣４００５００￣６００￣逡逑ｉ：：邋ｉ邋ｉ逡逑〗４」Ｊ」．［Ｌ丨：：９邐＾、逡逑＾邋Ｉ邋ｒｎ曑ｉ門(mén)＿邋ｉ門(mén)■邋ｉ門(mén)圈ｉ門(mén)Wｉ邋ｎ＿邐ｒ逡逑、邐２ｄ邋５ｄ邋９ｄ邋１３ｄ邋１７ｄ邋２１ｄ邋ｅ邋
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2710815