【摘要】：miRNAs是近來(lái)發(fā)現(xiàn)重要的表觀遺傳因子,其在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)起重要調(diào)控作用,并廣泛參與機(jī)體的各個(gè)生命過(guò)程。胚胎期的肌肉發(fā)育決定了肌纖維的總數(shù),對(duì)畜禽肌肉產(chǎn)量、生長(zhǎng)速度及成年體重等具有至關(guān)重要的影響。為探究miRNA對(duì)胚胎期骨骼肌發(fā)育的調(diào)控作用及其分子機(jī)制,并為肌肉發(fā)育調(diào)控尋找新的靶點(diǎn),以課題組前期通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)篩選到的雞成肌細(xì)胞由增殖到分化各不同時(shí)期差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNAs及預(yù)測(cè)的與其表達(dá)成負(fù)相關(guān)的靶基因(P0.01)信息為基礎(chǔ),本試驗(yàn)以其中顯著上調(diào)關(guān)鍵miRNA gga-miR-206(P0.01)作為研究的切入點(diǎn),并結(jié)合其他數(shù)據(jù)庫(kù)共同預(yù)測(cè)結(jié)果選取其中顯著下調(diào)的遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1(FUBP1)、胸腺素β4(TMSB4X)及酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白β(YWHAB)(P0.01)作為候選靶基因。分別通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量、雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)以三次獨(dú)立并至少兩次重復(fù)試驗(yàn),對(duì)miRNA及各候選靶基因的表達(dá)量以及靶關(guān)系進(jìn)行了探究和鑒定。主要結(jié)果如下:1、gga-miR-206及候選靶基因發(fā)育表達(dá)譜及相關(guān)關(guān)系分析。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,分析了 gga-miR-206與候選靶基因在胚胎發(fā)育各不同時(shí)期骨骼肌中的相對(duì)表達(dá)量并通過(guò)軟件對(duì)其之間相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明,gga-miR-206在腿肌中的表達(dá)整體呈先上升后下降的趨勢(shì),且在16胚齡(E16)達(dá)到高峰(P0.05),在胚胎發(fā)育后期至出生后又有所回升;而在胸肌中表達(dá)整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),10胚齡(E10)時(shí)表達(dá)量最高(P0.05),在16胚齡(E16)出現(xiàn)一個(gè)小高峰。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,在雞胚骨骼肌發(fā)育過(guò)程中,YWHAB的表達(dá)與gga-miR-206呈負(fù)相關(guān)(P0.05);其次,TMSB4X與gga-miR-206的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P0.05);與之相反,FUBP1的表達(dá)與gga-miR-206之間呈正相關(guān)(P0.05)。2、候選靶基因組織表達(dá)譜構(gòu)建。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)了三個(gè)候選靶基因在300日齡金茅黑雞A系母本8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)情況,對(duì)各基因功能進(jìn)行初步定位判斷,結(jié)果顯示:FUBP1富集于肝臟和腿肌組織,極顯著高于其余組織中的表達(dá)量(P0.01);相對(duì)于此,FUBP1在心肌中則表達(dá)較少,而在胸肌和卵巢組織中則幾乎不表達(dá);對(duì)于YWHAB則高表達(dá)于骨骼肌組織(P0.01),在心肌中也有少量表達(dá),而在脾和卵巢組織中表達(dá)最低;TMSB4X在各組織中均有不同程度表達(dá),在心肌和胸肌中相對(duì)高表達(dá),其次為腿肌、肝、脾、肺等組織,而在腎和卵巢組織中表達(dá)量最少,與其余組織間差異顯著或極顯著(P0.05 orP0.01)。3、gga-miR-206與YWHAB/FUBP1靶關(guān)系驗(yàn)證。結(jié)合前述研究?jī)?nèi)容,對(duì)gga-miR-206與YWHAB/FUBP1之間的靶關(guān)系進(jìn)行了鑒定。分別構(gòu)建YWHAB/FUBP13'UTR野生型和突變型pmirGLO表達(dá)載體,并與miR-206模擬物、陰性對(duì)照分別共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞,以轉(zhuǎn)染空載組作為空白對(duì)照。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,共轉(zhuǎn)染YWHAB野生型載體與miR-206 mimics組顯著降低螢火蟲(chóng)熒光素酶的相對(duì)活性(P0.05),但其余各組試驗(yàn)組與對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)果提示YWHAB與gga-miR-206存在靶關(guān)系,該基因mRNA3'UTR 1429-1435核苷酸序列為關(guān)鍵作用靶點(diǎn);FUBP1則不是gga-miR-206的靶基因。
【圖文】：

Ｍｌ邋２邋３邐４邋５邋６邋７邐８邋９邋１０邋１１邋１２逡逑■Ｈ逡逑９９９ｃ／９９９邋ｃｆｄ－９ｃｆ９逡逑圖２．１雞胚的性別鑒定結(jié)果逡逑６．邋２組織ＲＮＡ完整性檢測(cè)結(jié)果逡逑對(duì)提取的雞各胚齡骨骼肌組織總ＲＮＡ進(jìn)行檢測(cè)，１％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖２．２）顯逡逑示總ＲＮＡ的２８Ｓ和１８Ｓ條帶清晰，５Ｓ幾乎沒(méi)有，２８Ｓ條帶與１８Ｓ條帶的比值＞１．５；逡逑ＯＤ２６０／ＯＤ２８０介于１．８？２＿０之間。表明ＲＮＡ完整性好，無(wú)ＤＮＡ、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)污染，逡逑可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑＾２８Ｓ逡逑－ｌＯＯ逡逑ｍｎｎ＾ｉ－ｓｓ逡逑圖２．邋２邋ＲＮＡ完整性檢測(cè)逡逑（Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２、３、４邋為各樣品號(hào)）逡逑６．邋３邋ｍｉ邋ＲＮＡ定量分析逡逑ＡＢＩ邋７５００熒光定量ＰＣＲ結(jié)果顯示（圖２．３－圖２．４），擴(kuò)增曲線重疊性好，熔解曲線顯逡逑示為平滑的單峰，在Ｔｍ兩邊均無(wú)雜峰。表明所設(shè)計(jì)引物特異性良好，，無(wú)引物二聚體和非逡逑特異性擴(kuò)增。逡逑

圖２．１雞胚的性別鑒定結(jié)果逡逑６．邋２組織ＲＮＡ完整性檢測(cè)結(jié)果逡逑對(duì)提取的雞各胚齡骨骼肌組織總ＲＮＡ進(jìn)行檢測(cè)，１％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖２．２）顯逡逑示總ＲＮＡ的２８Ｓ和１８Ｓ條帶清晰，５Ｓ幾乎沒(méi)有，２８Ｓ條帶與１８Ｓ條帶的比值＞１．５；逡逑ＯＤ２６０／ＯＤ２８０介于１．８？２＿０之間。表明ＲＮＡ完整性好，無(wú)ＤＮＡ、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)污染，逡逑可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑＾２８Ｓ逡逑－ｌＯＯ逡逑ｍｎｎ＾ｉ－ｓｓ逡逑圖２．邋２邋ＲＮＡ完整性檢測(cè)逡逑（Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２、３、４邋為各樣品號(hào)）逡逑６．邋３邋ｍｉ邋ＲＮＡ定量分析逡逑ＡＢＩ邋７５００熒光定量ＰＣＲ結(jié)果顯示（圖２．３－圖２．４），擴(kuò)增曲線重疊性好，熔解曲線顯逡逑示為平滑的單峰，在Ｔｍ兩邊均無(wú)雜峰。表明所設(shè)計(jì)引物特異性良好，無(wú)引物二聚體和非逡逑特異性擴(kuò)增。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S831

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 肖玉華;;金茅酒 實(shí)現(xiàn)營(yíng)銷科技化[J];中國(guó)酒;2013年05期

2 沐春;;金茅出山:貴州金茅酒進(jìn)軍北京市場(chǎng)[J];中國(guó)酒;2010年01期

3 郭林;黃金茅孢堆黑粉菌新記錄種(英文)[J];菌物系統(tǒng);2000年03期

4 盧玉東;;天恩金茅創(chuàng)新?tīng)I(yíng)銷謀發(fā)展[J];中國(guó)酒;2013年10期

5 螢子;曉文;;貴州金茅酒業(yè)有限公司金茅酒專家品鑒會(huì)在筑舉行[J];釀酒科技;2018年11期

6 曉文;螢子;;金茅酒業(yè)精貴陳釀大師制酒專家鑒品會(huì)在筑舉行[J];釀酒科技;2019年12期

7 李廣義 ,周鵬飛;金茅酒業(yè)為中榜學(xué)子賀喜[J];農(nóng)村.農(nóng)業(yè).農(nóng)民;2004年07期

8 朱曉演;楊國(guó)明;孫江河;;金茅黃雞屠宰性能及部分肌肉品質(zhì)的研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年06期

9 陳蘭;張濤;王金玉;殷學(xué)梅;陳福祥;張跟喜;韋習(xí)會(huì);冒靜;;金茅黑雞GAS6基因的組織分布及其在脂肪組織中的發(fā)育性表達(dá)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2019年09期

10 管東生;香港鴨嘴草+野古草+金茅群落的生物量和第一性生產(chǎn)力[J];生態(tài)學(xué)雜志;1997年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 袁曼曼;吳鵬飛;殷學(xué)梅;李婷婷;王金玉;;FBXL5基因在不同雞品種中的組織表達(dá)譜及表達(dá)規(guī)律研究[A];2017中國(guó)長(zhǎng)三角遺傳學(xué)大會(huì)會(huì)議手冊(cè)[C];2017年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前5條

1 馬占全;白茅根要變成金茅根[N];湖北科技報(bào);2007年

2 趙鶴茂;后陽(yáng)村：“熱土計(jì)劃”[N];常州日?qǐng)?bào);2019年

3 楊天聞;長(zhǎng)治市大學(xué)生“村官”成為創(chuàng)業(yè)富民領(lǐng)頭雁[N];山西日?qǐng)?bào);2009年

4 本報(bào)記者 吳科任;黔酒出山品質(zhì)先行 資本助力做強(qiáng)做大[N];中國(guó)證券報(bào);2018年

5 本報(bào)記者 劉元靜;為了消費(fèi)者的生命安全[N];畢節(jié)日?qǐng)?bào);2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李國(guó)輝;金茅黑雞A系胸肌轉(zhuǎn)錄組特征及對(duì)重要肉用性狀的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 婁秋宏;gga-miR-206在金茅黑雞胚胎骨骼肌發(fā)育中的表達(dá)分析及靶基因驗(yàn)證[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

2 凌姣姣;PLIN基因?qū)鹈┗u生長(zhǎng)、屠宰和肉質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)及表達(dá)規(guī)律研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2017年

3 段煉;PPARα和PPARγ基因?qū)鹈┗u生長(zhǎng)、屠宰、肉質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)及表達(dá)規(guī)律研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2708461