發(fā)布時間：2020-06-10 16:28

【摘要】：禽多瘤病(Avian polyomavirus disease),又稱鸚鵡幼雛病(Budgerigar Fledgling Disease,BFD),是一種由禽多瘤病毒(Avian Polyomavirus,APV)引起的急性傳染病,可感染多個品種的鳥,但主要引起鸚鵡幼雛發(fā)病,該病能引起鸚鵡幼雛呼吸困難,羽毛發(fā)育不全、生長遲緩、消瘦等癥狀并最終導致死亡。20世紀末傳入我國,曾在我國湖北、山東、福建等省份爆發(fā),給當?shù)氐柠W鵡養(yǎng)殖企業(yè)帶來巨大損失。而到目前為止尚無針對禽多瘤病的有效疫苗及治療方法,因此,開展對APV的相關(guān)研究有著重要意義。本實驗從疑似禽多瘤病發(fā)病鸚鵡的肝臟中分離到一株病毒,基因序列分析和動物回歸試驗結(jié)果表明分離的病毒為禽多瘤病毒。試驗建立了一種SYBR Green熒光定量PCR(qPCR)方法以期能夠用于禽多瘤病的臨床診斷。通過建立的熒光定量PCR方法對APV在鸚鵡胚成纖維細胞上的增殖情況進行了研究,繪制了病毒增殖曲線。具體試驗結(jié)果如下:1.試驗采集了陜西臨潼地區(qū)的疑似禽多瘤病毒感染的病料,并用15日胚齡的健康鸚鵡胚制備了鸚鵡胚成纖維(BEF)原代細胞,通過將病料懸液接種到BEF細胞分離到了一株病毒,對分離病毒的VP1基因進行序列分析,發(fā)現(xiàn)該病毒與NCBI上公布的11株來自世界各地的禽多瘤病毒核苷酸、氨基酸序列同源性達99%以上,其中與我國山東、日本的分離株的同源性達100%。將分離的病毒接種健康的鸚鵡幼雛,其發(fā)病癥狀、病理變化與禽多瘤病的相似,從而證實分離的病毒為禽多瘤病毒。2.試驗構(gòu)建了209 bp的APV陽性標準質(zhì)粒,通過熒光定量PCR測定經(jīng)過10倍倍比稀釋的標準質(zhì)粒,得到標準曲線Y=㧟3.255X+40.867,從而建立了一種SYBR Green實時熒光定量PCR檢測方法。對該方法的多個方面進行評估,試驗結(jié)果表明,以4型禽腺病毒、H9N2型禽流感病毒、新城疫病毒作為模板時,均未檢測到有效熒光信號,僅禽多瘤病毒出現(xiàn)了特異性擴增曲線;在靈敏性試驗中,建立的熒光定量PCR方法相較于普通PCR其靈敏度高出100倍;在重復性試驗中,組內(nèi)重復試驗與組間重復試驗變異系數(shù)分別小于0.5%、1.5%。用該方法檢測臨床樣品,30份樣品檢出24份陽性,其檢出率高于普通PCR。綜上,試驗所建立的禽多瘤病毒熒光定量PCR檢測方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好的特點。3.利用建立的熒光定量PCR測定了禽多瘤病毒在接種到鸚鵡胚成纖維細胞后不同時間點的病毒拷貝數(shù),并根據(jù)測定得出的數(shù)據(jù)繪制了病毒增殖曲線,發(fā)現(xiàn)該病毒接種鸚鵡胚成纖維細胞12 h后開始大量復制,接種后60 h達到最大病毒滴度。這為以后大規(guī)模增殖禽多瘤病毒提供了重要的參考。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2706551