【摘要】：背景:隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,我區(qū)每年因奶牛養(yǎng)殖業(yè)排放的糞污高達(dá)400萬噸,奶牛糞便中攜帶的病原微生物、耐藥細(xì)菌和耐藥基因等,會對奶牛的健康養(yǎng)殖造成威脅,并隨著糞便還田利用成為食源性和環(huán)境的潛在污染源。目前,奶牛養(yǎng)殖業(yè)排放的糞污已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅健康養(yǎng)殖和公共衛(wèi)生安全的重要源頭之一。目的:通過研究明確銀川地區(qū)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場環(huán)境微生物群落多樣性及細(xì)菌耐藥性情況,以期為奶牛養(yǎng)殖業(yè)對環(huán)境及公共衛(wèi)生安全影響的風(fēng)險評估提供依據(jù),為開展病原微生物快速檢測技術(shù)和糞便無害化處理等相關(guān)應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。方法:通過采集銀川地區(qū)規(guī)�；膛ｐB(yǎng)殖場(簡稱“奶牛養(yǎng)殖場”)新鮮糞便、堆積糞便、污水和土壤樣本,采用16SrDNAV4區(qū)測序和宏基因組測序的方法,從宏觀的角度對奶牛養(yǎng)殖場環(huán)境微生物的群落多樣性進(jìn)行研究;采用經(jīng)典純化分離,細(xì)菌生化檢測和16S rDNA全長測序鑒定的方法從可培養(yǎng)微生物的角度對奶牛養(yǎng)殖場環(huán)境可培養(yǎng)細(xì)菌的群落多樣性進(jìn)行研究;采用K-B藥敏紙片檢測和耐藥基因PCR檢測的方法從耐藥表型和基因型的角度對奶牛養(yǎng)殖場環(huán)境可培養(yǎng)分離株進(jìn)行7種臨床常用抗菌藥(青霉素、丁胺卡那、林可霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、復(fù)方磺胺甲VA唑、紅霉素)及15種耐藥基因(磺胺類:sul1、sul2、sul3;四環(huán)素類:tetA、tetB、teD;氨基糖苷類:aacC4、aaatD;β-內(nèi)釀胺類:CTX-M、OXA、TEM：喹諾酮類:qnrA、aac(6')-Ib-cr、gyrA)的耐藥性研究。結(jié)果:(1)基于16S rDNA測序和宏基因組測序技術(shù)的研究結(jié)果表明,銀川地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場的新鮮糞便、堆積糞便、污水和土壤樣本中微生物群落組成豐富且多樣,通過16S rDNA測序共注釋了 55個門,143個綱,243個目,308個科,553個屬,其中Actinobacteria,Firmicutes和Bacteroidetes是優(yōu)勢菌門,占所有細(xì)菌群落的70%以上;宏基因組測序共注釋了 40個門,76個綱,167個目,373個科,1117個屬和3336個種,其中優(yōu)勢門(豐度在1%以上為優(yōu)勢菌)為 Actinobacteria,Bacteroidetes,Chloroflexi,Euryarchaeota,Firmicutes,Proteobacteria和Spirochaetes。進(jìn)一步研究其微生物組成發(fā)現(xiàn),芽胞桿菌屬(Bacillus,棒狀桿菌屬(Corynebacterium),葡萄球菌屬(staphylococcus)等菌屬在堆積糞便樣本和污水樣本中豐度顯著高于新鮮糞便和土壤樣本。(2)通過分離純化共獲得奶牛養(yǎng)殖場環(huán)境可培養(yǎng)細(xì)菌629株,經(jīng)鑒定共獲得鑒定株560株,分屬于52個屬和144個種。其中,336株為革蘭氏陽性菌,224株為革蘭氏陰性菌,且條件致病菌占83.04%(465/560),進(jìn)一步對分離的45株大腸埃希氏菌分離株進(jìn)行了血清學(xué)檢測,結(jié)果表明,優(yōu)勢血清型是0157:H7,所占比例高達(dá)40.00%。(3)通過對奶牛養(yǎng)殖場560株鑒定株的耐藥性研究結(jié)果表明,奶牛養(yǎng)殖場常用的7類抗菌藥物耐藥率較高,均在50%以上,其中堆積糞便樣本的分離株對青霉素和復(fù)方磺胺甲VA唑的耐藥率達(dá)100%,污水樣本的分離株對青霉素、林可霉素和復(fù)方磺胺甲VA唑耐藥率為100%:并且全部分離株皆為多重耐藥菌株,其中6耐菌株最多,占38.21%,污水樣本中7耐分離株最多,占44.12%。(4)通過對分離株的耐藥基因進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明,15種耐藥基因均檢測陽性,共檢測出陽性株249株,其中陽性率最高的為β-內(nèi)酰胺類TEM基因,達(dá)10.71%,最低的是磺胺類藥物sul3基因?yàn)?.89%,共有115種耐藥基因型,且單菌株最多檢測出攜帶9種耐藥基因(sull/su13/tetA/tetD/aacC2/aadD/TEM/qnrA/gyrA);基于宏基因組測序結(jié)果,共注釋了 1138個耐藥基因,且堆積糞便樣本中的耐藥基因注釋量差異顯著(P0.05)高于新鮮糞便和土壤樣本。結(jié)論:(1)銀川地區(qū)規(guī)�；膛ｐB(yǎng)殖場的新鮮糞便,堆積糞便,污水和土壤樣本中微生物群落組成多樣且在各樣本內(nèi)豐度存在差異。其中新鮮糞便樣本中的優(yōu)勢菌屬是擬桿菌屬(Bacteroides),密螺旋體屬(Treponema),普氏菌屬(Prevotella)和梭菌屬(Clostridium);在堆積糞便樣本中優(yōu)勢菌屬是假單胞菌屬(Psetudomonas),鏈霉菌屬(Streptomyces)和鹽單胞菌屬(Halomonas);在污水樣本中優(yōu)勢菌屬是紅育菌屬(Rhodoferax),擬桿菌屬(Bacteroides),嗜冷桿菌屬(Psychrobbacter)和黃桿菌屬(Flavobtbacterium);在土壤樣本中優(yōu)勢菌屬是分枝桿菌屬(Mycobacterium),諾卡氏菌(Nocarrdioides),鏈霉菌屬(Streptomyces)和考克氏菌屬(Kocuria)。并且新鮮糞便樣本和污水樣本的微生物群落構(gòu)成相似,堆積糞便和土壤樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)相似,但隨著分類階元的降低,樣本內(nèi)的微生物群落組成復(fù)雜度隨之增加,并且通過16S rDNA V4區(qū)測序和宏基因組測序的結(jié)果表明堆積糞便和污水中條件致病菌的豐度高于新鮮糞便和土壤樣本。(2)基于奶牛養(yǎng)殖場可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定,共鑒定560株分離株,其中83.04%的分離株為條件致病菌,揭示了銀川地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場糞污中可培養(yǎng)的條件致病菌種類及數(shù)量較為豐富,提示養(yǎng)殖場糞污是潛在的病原微生物傳播源,對奶牛的健康養(yǎng)殖和人類的餐桌安全造成極大的潛在威脅。(3)銀川地區(qū)規(guī)�；膛ｐB(yǎng)殖場的新鮮糞便,堆積糞便,污水和土壤樣本中微生物耐藥情況嚴(yán)重,對青霉素和復(fù)方磺胺甲VA唑兩種藥物的耐藥率高達(dá)100%,且560株分離株全部為多重耐藥菌株:4種樣本中堆積糞便和污水樣本的耐藥情況最為嚴(yán)峻。(4)銀川地區(qū)規(guī)�；膛ｐB(yǎng)殖場環(huán)境中耐藥基因的組成豐富,在糞污樣本(新鮮糞便,堆積糞便和污水)中耐藥基因豐度較高,是潛在的耐藥基因傳播源及儲存庫,對奶牛和人的健康及環(huán)境的安全造成潛在威脅。
【圖文】：

寧夏大學(xué)碩士學(xué)位論邐第二章基�。垮澹保�；Ｓ邋ｒＤＮＡ和宏基因組測序的奶中養(yǎng)殖場環(huán)境微生物多樣性分析逡逑行回收。使用ＴｒｕＳｅｑ？邋ＤＮＡ邋ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ邋Ｓａｍｐｌｅ邋Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)逡逑建后的文庫利用Ｑｕｂｉｔ和Ｑ－ＰＣＲ進(jìn)行定量，結(jié)果合格后，使用ＨｉＳｅｑ２５００邋ＰＥ２５０進(jìn)行上機(jī)逡逑測序。對測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理［１氣ＯＴＵ聚類和物種注釋＿］［＿，樣品復(fù)雜度分析和多樣逡逑品比較分析等（圖２－２）。逡逑

建后的文庫利用Ｑｕｂｉｔ和Ｑ－ＰＣＲ進(jìn)行定量，結(jié)果合格后，使用ＨｉＳｅｑ２５００邋ＰＥ２５０進(jìn)行上機(jī)逡逑測序。對測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理［１氣ＯＴＵ聚類和物種注釋＿］［＿，，樣品復(fù)雜度分析和多樣逡逑品比較分析等（圖２－２）。逡逑ａ邋－多樣性邐ＯＴＵ序列分析邐Ｐ邋？多樣性逡逑物種注釋逡逑ｆｌＥＳ＾３Ｂ逡逑＃ｗｐｐ９Ｐｉｍ逡逑Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑圖２－２邋１６Ｓ邋ｒＤＮＡ邋Ｖ４區(qū)測序及分析流程［＂0＊Ｈ２ｉ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ａｎｄ邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋１６Ｓ邋ｒＤＮＡ邋Ｖ４邋Ｒｅｇｉｏｎ逡逑２．２．３宏基因組測序樣本ＤＮＡ提取，文庫構(gòu)建，測序及信息分析逡逑（１）
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2705739