【摘要】：2016年4月,四川雙流某黑斑蛙(Rana nigromaculata)養(yǎng)殖場的蝌蚪爆發(fā)一種流行性傳染病,死亡率近90%,主要臨床特征為腹部腫脹,下頜與腹部等體表出血;剖檢見腹腔內(nèi)有淡黃色腹水,肝腫大充血,腸道空虛,腔內(nèi)充有大量黏液,脾腫大。組織病理學上,患病蝌蚪心、肝、腎、腸與脾等全身多組織器官受損,出現(xiàn)明顯的變性與壞死病灶,且在肝細胞與腸上皮等細胞胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)嗜堿性包涵體�；疾◎蝌浇M織勻漿液接種鯉魚上皮瘤細胞(Epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC),25℃恒溫培養(yǎng)4d,出現(xiàn)明顯的CPE,Reed-Muech法測得其滴度為10~7 TCID_(50)/0.1 mL。用5%濃度的病毒液浸泡8h對健康蝌蚪進行人工感染試驗,感染蝌蚪表現(xiàn)出與自然發(fā)病蝌蚪相似的癥狀,死亡率達到80%,證實分離病毒為該病病原。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病毒顆粒為正六邊形、有囊膜,對角線直徑約135±8nm,在胞質(zhì)中呈晶格狀排列或游離狀;主要衣殼蛋白基因(Maior capsid protein,MCP)序列分析表明其與蛙病毒屬病毒的相似性在99%以上。綜上,判斷此次黑斑蛙蝌蚪大量死亡的病原為虹彩病毒科蛙病毒屬病毒,將其命名為黑斑蛙蛙病毒(Rana nigromaculata ranavirus,RNRV)。采用常規(guī)研究方法,對RNRV的病毒滴度、酸堿敏感性、胰蛋白酶敏感性、有機試劑敏感性、溫度敏感性以及病毒最適培養(yǎng)細胞系、最適培養(yǎng)溫度、增殖特性等理化特性與表型進行測定。結(jié)果顯示RNRV具有與蛙病毒屬病毒相似的理化特性與表型,其對過酸(pH≤3)、過堿(pH≥10)、有機試劑及胰蛋白酶敏感;60℃作用30min可被滅活;最適培養(yǎng)細胞系為EPC和GCO,最適培養(yǎng)溫度范圍為25℃-28℃;在25℃條件下感染EPC細胞,12-24h內(nèi)病毒增殖速度達最大,36h后病毒增殖速度減緩,在72-96 h則進入生長平臺期�；诟咄繙y序技術(shù),采用HiSeq2000測序儀對RNRV進行了全基因組測序。結(jié)果顯示,該病毒基因組序列全長為104286 bp,包括104個ORFs,其中已知功能的有55個,未知功能的有49個,它們所編碼蛋白的氨基酸長度在41-1293AA之間,分子量在4.4-140.8KDa之間,整個基因組GC含量為55.2%,且在基因組序列中的79069-79186bp位置間存在59個CA重復。通過點陣分析發(fā)現(xiàn)RNRV基因組與RGV最為相似;以RNRV 26個核心基因編碼蛋白的串聯(lián)氨基酸序列與其他14株虹彩病毒相關(guān)序列根據(jù)鄰近法共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),RNRV歸屬于蛙病毒屬FV3病毒類群,且在進化關(guān)系上與分離自中國的RGV、STIV的親緣關(guān)系最近。
【圖文】：

質(zhì)囊膜約厚4nm，其表面鑲嵌著內(nèi)層囊膜蛋白（Intramembranousproteioxvirus）相似，該內(nèi)層囊膜可能來源自宿主細胞的高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，配和病毒感染方面參與重要作用[29]；病毒衣殼由衣殼蛋白亞單位排列位主要由主要衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）組成，該蛋白是保守的結(jié)構(gòu)蛋白，大小約為48kDa，一般情況下能占到病毒總蛋白的45%的囊膜位于粒子的最外層，是病毒出芽過程中從宿主細胞的細胞膜釋放蛙病毒區(qū)別于其他DNA 病毒的一個重要特征，同時囊膜中存在有能夠與入侵能力的受體結(jié)合蛋白[31]，這對有囊膜病毒對宿主的感染力的提用。蛙病毒在感染宿主細胞時，，通常會在胞漿中形成一片電子密度較淺毒的DNA 與編碼好的病毒衣殼蛋白在該區(qū)域組裝成一個完整的病毒顆粒在胞漿中游離或聚集成整齊的晶格狀結(jié)構(gòu)（Paracrystallinearray），該的照射下呈藍紫色虹彩，故名虹彩病毒，且電子顯微鏡下的晶格狀排列病毒的典型特征之一。

剖檢可見腹腔內(nèi)有淡黃色腹水，肝腫大充血，腸道空虛且腔內(nèi)充有大量黏液，脾腫大（圖2.1 C、D）。患病蝌蚪體表粘液與腸腔內(nèi)均未檢測到寄生蟲存在；患病蝌蚪肝臟與腹水的組織涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢也未觀察到細菌。圖 2.1 患病蝌蚪臨床癥狀。A、B 為患病蝌蚪體表癥狀，箭頭所示位置可見腹部腫脹，體表多處出血，C、D 為患病蝌蚪剖解病變，箭頭所示為肝腫大出血。Fig.2.1 Clinical symptoms of moribund tadpoles. A, B represent symptoms of diseased tadpoles’ bodysurface, the arrowhead area shows swollen abdomen and hemorrhage on body surface. C, D representsymptoms of diseased tadpoles’ inner organs. the arrowhead area shows congestion and swelling of theliver.20
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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本文編號：2705304