【摘要】：豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一種接觸性呼吸道傳染病,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病常與其它疾病混合感染或繼發(fā)感染,使病情更加復(fù)雜,免疫預(yù)防成為了防控該病的重要途徑。但是,APP分為16個血清型,且主要的血清型之間缺乏交叉免疫保護,導(dǎo)致疫苗研究進展緩慢。APP疫苗研究主要集中在亞單位結(jié)構(gòu)上,但其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,分子較大,暴露在分子表面的有效抗原表位較少。有關(guān)APP表位疫苗的研究鮮有報道,表位疫苗免疫后細胞因子變化的相關(guān)研究更是少見。因此,設(shè)計APP表位疫苗并研究其免疫對攻毒后細胞因子的影響,對于更好地預(yù)防該病具有重要意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)APP的三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素(TAA)的頭部(ADH)是其關(guān)鍵功能區(qū),在細菌的粘附、侵襲、生物被膜的形成和逃避宿主免疫應(yīng)答方面有重要作用,而且ADH對APP的感染具有免疫保護作用。另外,課題組發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes,PA)與APP有較強的交叉免疫保護,其共同抗原表位Ba1、Bb5、C1可以有效地預(yù)防APP感染。此外,深入研究發(fā)現(xiàn)APP的外毒素ApxⅣ上的表位PH1、高親和力細胞周質(zhì)鋅轉(zhuǎn)運蛋白上的表位PH2與PA的單鏈DNA結(jié)合蛋白具有較高的同源性,且對APP感染具有較好的免疫保護效果。為研究表位抗原的免疫效果和細胞因子對免疫效果的影響,本試驗利用DNAstar軟件和Bepipred 1.0共同預(yù)測ADH的有效抗原表位,并將其與Ba1、Bb5、C1、PH1和PH2通過柔性linker串聯(lián)起來,并比較獲得最佳組合序列。基因合成后構(gòu)建原核表達載體p ET28a-RTA,經(jīng)大腸桿菌BL21原核表達后通過鎳柱親和層析法純化出目的蛋白RTA。在0、14、28 d時將其與鋁膠鹽水佐劑混勻后背部皮下免疫ICR小鼠,同時設(shè)置APP5b活菌、APP1滅活菌、APP5b滅活菌和PBS組作為對照,并在0、14、28、35 d分別進行尾靜脈采血以檢測血清抗體效價。在35 d進行APP1和APP5b攻毒前24 h和0 h分別給兩組RTA蛋白免疫組進行腹腔注射IL-2、滴鼻GM-CSF處理。攻毒感染后觀察臨床癥狀和小鼠體重丟失情況,3天后處死小鼠,檢測肺指數(shù)、肺勻漿中T淋巴細胞數(shù)、存活率以及BALF和血清中細胞因子的變化情況,以評價RTA蛋白的免疫保護效果和對細胞因子的影響及IL-2、GM-CSF的預(yù)處理對RTA蛋白保護效果的影響。結(jié)果顯示,RTA蛋白大小為20.6 k Da,其最佳表達條件是37℃誘導(dǎo)表達6-8 h。Western blot結(jié)果顯示RTA蛋白與抗APP5b高免血清具有良好的結(jié)合活性。將RTA蛋白免疫后,ICR小鼠產(chǎn)生了103數(shù)量級的抗體效價,且產(chǎn)生的抗體能與APP1和APP5b特異性結(jié)合。攻毒感染后RTA蛋白有效地減輕了臨床癥狀和體重丟失,IL-2和GM-CSF預(yù)處理后肺指數(shù)略高于RTA免疫組,IL-2的預(yù)處理使肺勻漿中的T細胞數(shù)減少,GM-CSF則不影響T細胞的數(shù)目。RTA蛋白免疫使小鼠對APP1感染產(chǎn)生了40%的保護率。這些結(jié)果表明RTA蛋白對APP感染有一定的免疫保護作用,IL-2和GM-CSF預(yù)處理降低了RTA蛋白的保護作用。此外,RTA免疫組細胞因子IL-17、IL-1β、Fas-Ligand、IL-21、G-CSF、CCL4水平降低,表明RTA免疫有效地降低了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。與RTA組相比,IL-2和GM-CSF預(yù)處理上調(diào)了TNF-α、IL-1β、IL-21、G-CSF、GM-CSF、CCL4等炎性因子,加重了炎癥反應(yīng),從而降低了RTA蛋白的免疫保護效果。本研究設(shè)計了表位抗原RTA,并通過臨床癥狀、體重丟失、存活率和細胞因子變化等指標綜合評價了RTA蛋白的免疫保護效果,為APP新型表位疫苗的設(shè)計提供了理論基礎(chǔ),對于預(yù)防APP的感染具有重要意義。
【圖文】：

圖 1.1 ADH 粘附基序分布Fig 1.1 The distribution of adhesion gene sequence of ADH利用 DNAstar 對 124-612 aa 處粘附序列進行表位預(yù)測，，根據(jù) Chou-Fasman法和Garnier-Robson法預(yù)測ADH的二級結(jié)構(gòu)，可見共同α螺旋區(qū)域位于333-334、449-453 aa 處，共同 β 折疊區(qū)域位于 144-162、176-184、189-192、218-221、255-257、280-287、344-346、357-360、372-374、385-389、402-405、410-421、440-443、469-471、510-512、525-529、535-540、550-554、564-569、574-583、597-599、608-612 aa 處，無規(guī)則卷曲位于 125-128、223-225、236-238、258-265、275-279、306-308、323-325、421-423、431-439、522-523、569-573、586-588、600-603 aa處（圖 1.2）。

圖 1.1 ADH 粘附基序分布Fig 1.1 The distribution of adhesion gene sequence of ADH利用 DNAstar 對 124-612 aa 處粘附序列進行表位預(yù)測，根據(jù) Chou-Fasman法和Garnier-Robson法預(yù)測ADH的二級結(jié)構(gòu)，可見共同α螺旋區(qū)域位于333-334、449-453 aa 處，共同 β 折疊區(qū)域位于 144-162、176-184、189-192、218-221、255-257、280-287、344-346、357-360、372-374、385-389、402-405、410-421、440-443、469-471、510-512、525-529、535-540、550-554、564-569、574-583、597-599、608-612 aa 處，無規(guī)則卷曲位于 125-128、223-225、236-238、258-265、275-279、306-308、323-325、421-423、431-439、522-523、569-573、586-588、600-603 aa處（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

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本文編號：2703839