【摘要】：乳房炎是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟損失的重要常見病之一,同時對人類食品安全形成嚴重威脅。通過體外和體內(nèi)試驗,從細胞和分子水平系統(tǒng)研究了姜黃素對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)所誘導的乳腺炎模型小鼠的抑菌作用和抗炎作用機制。為我課題組前期研究的以姜黃素為主要有效成分、治療奶牛乳房炎的蒙獸藥復方姜黃乳炎散的臨床應用和推廣提供數(shù)據(jù)支持,奠定理論基礎。研究分為3個試驗,試驗1針對姜黃乳炎散、姜黃素和抗生素對致病性S.aureus的抑菌作用研究;試驗2選取250只小鼠,隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組(抗生素組)、姜黃乳炎散組和姜黃素組。除空白對照組和模型組灌服滅菌生理鹽水外,其余3個組分別灌服0.13 g/kg環(huán)丙沙星、1.0 g/kg姜黃乳炎散和腹腔注射0.125 g/kg姜黃素,連續(xù)5 d,2次/d。試驗結(jié)束后,采集樣品,用ELISA法進行相關指標的檢測,研究了姜黃乳炎散和姜黃素對乳源致病性S.ureus所誘導的乳腺炎模型小鼠的抗炎免疫作用機制;試驗3通過分離、鑒定、培養(yǎng)乳腺上皮細胞,研究了姜黃素對TLR2受體介導的MMECs中NF-κB信號通路的影響。研究結(jié)果如下:試驗1:姜黃素對乳源致病性金黃色葡萄球菌體外抑菌作用研究試驗分別用紙片擴散法、肉湯稀釋法檢測了姜黃素對乳源S..aureus的抑菌作用。結(jié)果顯示,姜黃乳炎散和姜黃素對S.aureus均有良好的抑菌效果,1 MIC的姜黃素對濃度為1 X 107 cfu/mL的S.aures抑菌作用最為明顯(P0.05)。分別采用酶標比濁法、微生物黏附法和試劑盒法,測定姜黃素和姜黃乳炎散對S.aureus生長曲線、菌體表面疏水性、細胞壁及細胞膜滲透性的影響。結(jié)果表明,姜黃乳炎散和姜黃素對致病性S.aureus的生長曲線、細胞壁和細胞膜通透性均產(chǎn)生不同程度影響,從而起到抑菌作用。試驗2:姜黃素和姜黃乳炎散對金黃色葡萄球菌所誘導的乳腺炎模型小鼠作用機制研究①S.aureus對乳腺炎小鼠乳腺組織形態(tài)的影響:乳源S.aureus在建模后可導致小鼠乳腺腺泡減少,結(jié)締組織增生;小葉間導管內(nèi)可見中性粒細胞浸潤。而姜黃素和姜黃乳炎散組小鼠腺泡間淋巴細胞數(shù)量增多,中性粒細胞減少,其中,姜黃乳炎散組腺泡內(nèi)成纖維細胞逐漸增多,結(jié)締組織逐漸形成,較早得以修復。②以模型組Oh為空白對照組,在24～120 h之間,姜黃素、姜黃乳炎散及鹽酸環(huán)丙沙星組中乳腺炎小鼠模型臟器指數(shù)顯著高于模型組(P0.05)。③通過流式細胞術、ELISA法和MTT法分別檢測淋巴細胞及其亞群、炎性細胞因子及自然殺傷細胞(Natural killer cell,NK)的水平。與模型組相比,姜黃素、姜黃乳炎散及鹽酸環(huán)丙沙星可顯著抑制CD8+、TNF-α、IL-6、IL-1和IL-8的表達(P0.05),增強CD4+、CD3+、CD19+細胞含量和NK細胞活性,使IFN-γ、IL-2和IL-10等細胞因子的釋放增加,從而提高抗炎免疫力。試驗3:姜黃素對TLR2受體介導的MMECs中NF-κB信號通路研究①通過改良混合酶消化法結(jié)合差速貼壁法從小鼠乳腺中分離高純度的MMECs,經(jīng)細胞角蛋白8/18鑒定MMECs為陽性。②通過Real-Time PCR和ELISA分析發(fā)現(xiàn),1.0×106 cfu/mL作用24 h時S.aureus引起炎癥反應的效果最佳,同時,姜黃素20μg/mL作用12h對S.aureus抑制效果最佳。③通過Real-Time PCR和Western Blot技術對IL-1β、IL-6、TNF-α表達分析發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路顯著降低炎癥因子的分泌(P0.05)。結(jié)論:姜黃素和姜黃乳炎散可在體外顯著抑制S.aureus生長;通過提高乳腺炎模型小鼠免疫臟器指數(shù)、增強NK(Natural killer cell)細胞活性和淋巴細胞及其亞群的活性、調(diào)控不同細胞因子,以及作用于乳腺上皮細胞的NF-κB信號通路,進而提高小鼠的非特異性免疫功能和抗炎效果。姜黃素對S.aureus的抗菌和抗炎癥作用機制的研究將對蒙獸藥姜黃乳炎散用于臨床治療奶牛乳房炎提供重要參考依據(jù)。
【圖文】：

圖３邋ＮＦ－ｋＢ信號通路圖逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＮＦ－ｋＢ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑

Ｆｉｇ．邋４邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋Ｃｕｒｃｕｍｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ逡逑２．３．４姜黃素對金黃色葡萄球細胞膜完整性的影響逡逑菌體總糖和總磷內(nèi)容物質(zhì)的釋放可表明姜黃素、ＪＨＲＹＳ及萬古霉素對菌體膜完逡逑整性的影響（見表４）。分別加入１邋ＭＩＣ的姜黃素、ＪＨＲＹＳ及萬古霉素后，叉逡逑在0Ｄ２６Ｑｎｍ下的吸光值逐漸增加，且均顯著高于０邋ＭＩＣ濃度的姜黃素、ＪＨＲＹＳ及萬逡逑古霉素的值（Ｐ＜0．0５）。同時，總磷的釋放趨勢和總糖一致，陰性對照組０邋ＭＩＣ逡逑和１邋ＭＩＣ無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。姜黃素、ＪＨＲＹＳ及萬古霉素的加入使菌體總磷含逡逑量增加了邋７倍左右。因此，，姜黃素、ＪＨＲＹＳ及萬古霉素均能使菌體中總糖和總磷的逡逑濃度顯著增加（尸＜0．0５），進一步說明，姜黃素、ＪＨＲＹＳ及萬古霉素對５１逡逑具有抑菌作用。逡逑表４姜黃素對５＂．邋ｆｌｗｒｅｗｓ內(nèi)容物釋放的影響逡逑Ｔａｂｌｅ邋４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｃｕｒｃｕｍｉｎ邋ｏｎ邋ｒｅｌｅａｓｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｗｉｔｈｉｎ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋（１．０Ｘ１０７ｃｆ＼ｉ／ｍＬ）逡逑組別邐藥物濃度邐總糖濃度Ｕ２６０ｎｍ）邐總磷濃度（４６０ｃｍ）逡逑
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.23

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本文編號：2703144