【摘要】：胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎著床和妊娠建立過程中起著至關(guān)重要的作用。已有研究表明生理或病理性缺氧從多種層面影響胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的生理功能。但目前缺氧對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞生理功能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究基于“缺氧通過對山羊胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞(GTC)生物鐘及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生影響從而調(diào)控其生理功能”這一科學(xué)假說,通過CoCl_2和dimethyloxalylglycine(DMOG)建立GTC缺氧模型,運用real time PCR(qPCR)、實時生物熒光素酶測定系統(tǒng)(Kronos Dio AB-2550)和Western blotting等方法檢測缺氧對GTC生物鐘、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路及類固醇合成基因表達(dá)的影響。主要結(jié)果如下:1.用CCK-8試劑盒分別檢測不同濃度(0μM,100μM,200μM,400μM)的CoCl_2處理GTC在不同時間點(12 h、24 h和36 h)的細(xì)胞活力,結(jié)果表明200μM的CoCl_2是對GTC無明顯細(xì)胞毒性的最大濃度。查閱文獻(xiàn)并經(jīng)驗證500μM的DMOG為誘導(dǎo)GTC缺氧的適宜濃度。GTC經(jīng)100 nM地塞米松(DXM)同步化處理2 h后,分別用200μM的CoCl_2和500μM的DMOG處理細(xì)胞,收集處理后不同時間點(12 h、16 h、20 h、24 h、28 h和32 h)的細(xì)胞樣品,qPCR方法檢測缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α蛋白的靶基因Glut1和Vegfα的表達(dá)情況,運用雙因素方差檢驗(Two way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示,GTC經(jīng)CoCl_2處理后Glut1 mRNA的表達(dá)與對照組相比明顯上升(P0.001),而Vegfα的表達(dá)與對照組相比無明顯差異(P0.05)。GTC經(jīng)DMOG處理后Glut1與VegfαmRNA的表達(dá)與對照組相比均明顯上升(P0.001)。上述結(jié)果表明,GTC的缺氧模型成功構(gòu)建。2.運用慢病毒技術(shù)將重組慢病毒載體pLV6-Bmal1-Luc轉(zhuǎn)染GTC。細(xì)胞經(jīng)100 nM DXM同步化處理2 h后,分為2組,一組用500μM的DMOG處理,一組用相同體積的DMSO處理,Kronos Dio AB-2550系統(tǒng)實時檢測Bmal1啟動子調(diào)控下的熒光素酶Luc活性的變化情況。結(jié)果顯示,Bmal1-Luc在DMSO和DMOG處理組中呈現(xiàn)明顯的節(jié)律性振蕩,同時DMOG處理后,Bmal1-Luc周期明顯增加(P0.001),振幅顯著下降(P0.001),間接表明缺氧對GTC的生物鐘系統(tǒng)具有顯著的影響。3.qPCR方法檢測200μM的CoCl_2和500μM的DMOG分別處理后不同時間點GTC核心生物鐘基因的表達(dá)情況。運用Cosinor方法進(jìn)行基因表達(dá)節(jié)律性分析,Two way ANOVA進(jìn)行不同處理造成的差異性分析。結(jié)果顯示:(1)正常情況下,GTC的核心生物鐘基因(Bmal1、Dbp、Cry2和Per1)均呈現(xiàn)明顯的節(jié)律性表達(dá)(P0.05)。(2)GTC經(jīng)200μM的CoCl_2處理后其核心生物鐘基因Bmal1和Cry2表達(dá)明顯降低(P0.05),Per1的表達(dá)明顯升高(P0.001),而Dbp的表達(dá)無顯著變化(P0.05);同時Dbp和Cry2的表達(dá)節(jié)律性消失(P0.05),而Bmal1和Per1仍呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)(P0.05)。(3)GTC經(jīng)500μM的DMOG處理后其核心生物鐘基因Bmal1表達(dá)明顯降低(P0.001),Per1的表達(dá)明顯升高(P0.001),而Dbp和Cry2的表達(dá)無顯著變化(P0.05);同時DMOG處理后Bmal1、Dbp、Per1和Cry2仍呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)(P0.001)。上述結(jié)果表明缺氧對GTC的生物鐘具有顯著的影響,但可能由于CoCl_2和DMOG誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧的機(jī)制不同,其引起的變化也并不完全一致。4.運用Western bloting檢測200μM CoCl_2處理后GTC在特定時間點12 h和32 h內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,CoCl_2誘導(dǎo)的GTC缺氧會使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為GRP78和ATF6蛋白水平的升高(P0.05),phospho IRE1a蛋白水平的降低(P0.05)。5.qPCR分別檢測200μM的CoCl_2和500μM的DMOG處理后GTC在不同時間點其類固醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示CoCl_2誘導(dǎo)GTC缺氧后其類固醇激素合成相關(guān)基因Star表達(dá)顯著降低(P0.001);同時,DMOG誘導(dǎo)GTC缺氧后其類固醇激素合成相關(guān)基因Star表達(dá)水平無顯著差異(P0.05),而Hsd3β表達(dá)水平顯著降低(P0.001),提示缺氧刺激可能通過生物鐘和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路對GTC類固醇激素的合成產(chǎn)生重要影響。綜上所述,CoCl_2和DMOG能夠誘導(dǎo)GTC缺氧,從而引起GTC生物鐘核心基因表達(dá)水平與節(jié)律的改變,同時引起GTC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白和類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)水平的改變。
【圖文】：

第一章 缺氧調(diào)控細(xì)胞生物鐘和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的研究進(jìn)展 DMOG 抑制羥化酶并誘導(dǎo) HIF-1 依賴性轉(zhuǎn)錄（Nguyen el al. 2013） PHD2 的 2-OG 強(qiáng)烈結(jié)合，充當(dāng)競爭性抑制劑。l2和 DMOG 作為誘導(dǎo)體外模擬細(xì)胞缺氧的試劑，誘導(dǎo)缺氧機(jī)理如圖 17）所示，二者基本涵蓋了通過不同的機(jī)制上調(diào) HIF-1α蛋白。

圖 1-1 哺乳動物晝夜節(jié)律分子調(diào)控機(jī)制（Jennifer el al. 2012）Fig.1-1 The molecular regulation mechanism of mammalian circadian rhythm鐘核心基因 Bmal1 編碼蛋白 BMAL1 屬于堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（bHL員，是組成生物鐘轉(zhuǎn)錄、翻譯正負(fù)反饋機(jī)制的核心因子，與另一個生ck 結(jié)合形成 BMAL1/CLOCK 二聚體在反饋環(huán)中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。錄 因 子 BMAL1/CLOCK 蛋 白 質(zhì) 二 聚 體 首 先 激 活 順 勢 作 用 元CGTG-3’）或 E’-box（5’-CACGTT-3’），以啟動 Pers 和 Crys 下游基l. 2006）。數(shù)小時后，細(xì)胞質(zhì)中積累的 PER 和 CRY 轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核CLOCK 的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，形成核心負(fù)反k el al. 2012；Richards el al. 2013）。在核心反饋環(huán)外圍，核受體 RE作為補充機(jī)制來參與生物鐘 24 h 節(jié)律性震蕩的產(chǎn)生，BMAL1/CL進(jìn) Rev-erbα和 Rorα的轉(zhuǎn)錄，反過來，RORα和 REV-ERBα蛋白能通過1的啟動子特異序列RRE 上分別促進(jìn)和抑制Bmal1的轉(zhuǎn)錄（Preitner ond el al. 2005；Liu el al. 2008）。此外酪蛋白激酶 CK1ε/δ通過磷酸化到生物鐘節(jié)律的維持。與此同時，，BMAL1/CLOCK 也通過激活 E-bo
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S827

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭金虎;徐瓔;張二荃;王晗;何群;殷文璇;馮雪蓮;杜生明;;生物鐘研究進(jìn)展及重要前沿科學(xué)問題[J];中國科學(xué)基金;2014年03期

本文編號：2701608