【摘要】：細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重,使得有些細(xì)菌感染達(dá)到了無(wú)藥可用的境地,因此研發(fā)新型抗菌藥物成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。噬菌體及其裂解酶可以特異、高效地裂解細(xì)菌,成為治療細(xì)菌性感染,特別是耐藥性細(xì)菌感染的一種新型生物制劑,展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。糞腸球菌(Enterococcus faecalis)是一種機(jī)會(huì)致病菌,可以造成多種局部或全身性的感染性疾病。由于抗生素的濫用和糞腸球菌對(duì)許多抗生素的固有耐藥,使得臨床上由治療糞腸球菌造成的感染變得非常困難。本研究以耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌噬菌體EF-P10及其裂解酶LysEF-P10為研究對(duì)象,對(duì)其作為抗菌制劑的應(yīng)用潛力及其裂解機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本研究首先獲得了40株多重耐藥的糞腸球菌,并以耐萬(wàn)古霉素的糞腸球菌(Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis,VREF)N10為宿主菌從污水中分離并純化得到了一株烈性噬菌體EF-P10,透射電鏡顯示其屬于長(zhǎng)尾噬菌體科,基因組類型鑒定表明EF-P10為雙鏈DNA病毒。EF-P10對(duì)其宿主菌表現(xiàn)出了高效的殺菌活性,但裂解譜較窄。對(duì)EF-P10進(jìn)行了全基因組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)EF-P10全長(zhǎng)為57 408 bp,具有127個(gè)開(kāi)放閱讀框,比對(duì)和分析結(jié)果表明ORF60所編碼的蛋白為其裂解酶LysEF-P10。對(duì)LysEF-P10進(jìn)行了原核表達(dá)與純化,體外實(shí)驗(yàn)表明,LysEF-P10具有高效的殺菌活性,其裂解譜遠(yuǎn)遠(yuǎn)寬于親本噬菌體。將糞腸球菌與LysEF-P10連續(xù)作用多代不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)LysEF-P10產(chǎn)生抗性,預(yù)示其有廣闊的應(yīng)用前景。隨后,本研究對(duì)LysEF-P10的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了深入研究,通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和分析可知,LysEF-P10包含一個(gè)N端CHAP結(jié)構(gòu)域(LysEF-P10C)和C端的假定細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LysEF-P10B)。為了驗(yàn)證各結(jié)構(gòu)域的功能,分別對(duì)LysEF-P10C和LysEF-P10B進(jìn)行了原核表達(dá)和純化。體外殺菌實(shí)驗(yàn)表明單獨(dú)的LysEF-P10C和LysEF-P10B都不具有殺菌活性,只有完整的全酶才具有活性。為了直觀地看到與宿主菌結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,將LysEF-P10C、LysEF-P10B分別和GFP蛋白進(jìn)行融合,得到LysEF-P10C-GFP和LysEF-P10B-GFP融合蛋白,并用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)兩個(gè)融合蛋白與糞腸球菌N10的結(jié)合能力,結(jié)果只有LysEF-P10B-GFP能與糞腸球菌N10發(fā)生特異性結(jié)合,表明LysEF-P10B是LysEF-P10中發(fā)揮結(jié)合作用的結(jié)構(gòu)域。以金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysGH15的CHAP片段為模板,預(yù)測(cè)得到了置信度為100%的LysEF-P10C的3D結(jié)構(gòu),二者在結(jié)構(gòu)上具有很高的同源性。通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建的3D結(jié)構(gòu)模型,預(yù)測(cè)得到了LysEF-P10C中可能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)D20、D22、D31、C29、H90和N110,并將這些位點(diǎn)逐一單位點(diǎn)突變?yōu)楸彼�。圓二色譜結(jié)果表明,突變前后蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生改變。體外殺菌活性表明,EDTA處理后LysEF-P10的活性全部喪失,回補(bǔ)Ca~(2+)活性恢復(fù),這表明Ca~(2+)對(duì)維持LysEF-P10的殺菌活性是必需的;D20A、D22A和D31A突變體蛋白活性全部喪失,ICP-AES結(jié)果表明突變后Ca~(2+)含量顯著降低,回補(bǔ)Ca~(2+)后突變體蛋白活性并沒(méi)有恢復(fù),這表明D20、D22和D31是結(jié)合Ca~(2+)的關(guān)鍵位點(diǎn);C29A、H90A和N110A突變體蛋白的活性也全部喪失,但I(xiàn)CP-AES結(jié)果表明突變后Ca~(2+)含量沒(méi)有顯著變化,說(shuō)明這三個(gè)位點(diǎn)是起催化作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。本文進(jìn)一步評(píng)價(jià)了LysEF-P10在體內(nèi)的治療效果、免疫原性、對(duì)腸道菌群的影響及其安全性。治療實(shí)驗(yàn)表明,攻菌后1 h腹腔注射5.0μg LysEF-P10就可以100%保護(hù)感染致死劑量VREF的小鼠,且顯著降低小鼠血液中的載菌量。免疫原性實(shí)驗(yàn)表明LysEF-P10可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)LysEF-P10的特異性抗體,一次性注射5.0μg LysEF-P10后的第三周抗體滴度達(dá)到最高(1:100),主要抗體類型為IgG。中和實(shí)驗(yàn)表明anti-LysEF-P10的抗體并不會(huì)影響LysEF-P10在體外的殺菌活性,同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明特異性抗體不會(huì)影響LysEF-P10在體內(nèi)的治療效果。為了評(píng)價(jià)LysEF-P10在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)對(duì)腸道菌群的影響,對(duì)小鼠糞便中的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析,結(jié)果表明,當(dāng)給小鼠腹腔注射致死劑量的VREF 24 h后小鼠糞便中腸球菌屬細(xì)菌的豐度顯著升高,腸道菌群平衡狀態(tài)受到干擾;攻菌后1 h用5.0μg LysEF-P10對(duì)其進(jìn)行治療,小鼠糞便中腸球菌屬細(xì)菌的豐度顯著降低,腸道菌群的失衡狀態(tài)得到一定程度的恢復(fù)。單獨(dú)腹腔注射100.0μg LysEF-P10也會(huì)在24 h內(nèi)使小鼠糞便中腸球菌屬細(xì)菌的豐度顯著降低。對(duì)小鼠的安全性試驗(yàn)表明,即使腹腔注射大劑量LysEF-P10(5.0 mg)也不會(huì)對(duì)小鼠產(chǎn)生明顯的副作用,表明LysEF-P10在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)具有良好的安全性。綜上所述,本研究為全面解析糞腸球菌噬菌體及其裂解酶的生物學(xué)特性以及LysEF-P10在治療多重耐藥糞腸球菌感染中應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.611

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