【摘要】：對(duì)于禽類(lèi),一些大腸桿菌能夠通過(guò)定植在腸道導(dǎo)致腸內(nèi)感染,同時(shí)也能轉(zhuǎn)移到腸外導(dǎo)致腸外感染,主要感染3～7周齡的雛雞,臨床表現(xiàn)為心包炎、肝周炎、腹膜炎、眼炎等癥狀,給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。達(dá)氟沙星(氟喹諾酮類(lèi))和安普霉素(氨基糖苷類(lèi))是兩種獸醫(yī)專(zhuān)用廣譜抗生素,常用于預(yù)防和治療雞、豬等動(dòng)物的革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)引起的感染。目前由于抗生素的長(zhǎng)期不規(guī)范使用,大腸桿菌的耐藥性問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重。然而國(guó)內(nèi)外尚未建立這兩種藥物對(duì)大腸桿菌的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)。本研究旨在通過(guò)建立達(dá)氟沙星和安普霉素的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn),為規(guī)范這兩種藥物在我國(guó)獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。(1)達(dá)氟沙星和安普霉素對(duì)大腸桿菌的野生型臨界值(COWT)的測(cè)定本研究從全國(guó)各大規(guī)�；B(yǎng)雞場(chǎng)采集并分離鑒定了 1412株雞源大腸桿菌,采用微量肉湯稀釋法測(cè)得達(dá)氟沙星和安普霉素的最小抑菌濃度(MIC)。達(dá)氟沙星在0.125～64 μg/mL濃度范圍內(nèi)的MIC呈雙峰分布,峰值分別為0.5μg/mL和8 μg/mL,其中MIC為8μg/mL時(shí)細(xì)菌有215株,占15.7%,分布最多。達(dá)氟沙星對(duì)雞大腸桿菌的MIC50為4μg/mL,MIC90為64μg/mL。而安普霉素在2～256 μg/mL濃度范圍中呈單峰分布,峰值為MIC=8μg/mL,此處細(xì)菌有828株,占60.7%。安普霉素對(duì)大腸桿菌的MIC50為8μg/mL,MIC90為16μg/mL。將兩種藥物的MIC值轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)og2MIC,進(jìn)而采用非線性回歸分析、NORMINV和NORMDIST方法建立達(dá)氟沙星和安普霉素的COWT分別為4 μg/mL和16 μg/mL。(2)大腸桿菌對(duì)達(dá)氟沙星和安普霉素的耐藥特點(diǎn)分析選擇不同MIC值的大腸桿菌,用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法檢測(cè)耐藥基因與MIC的相關(guān)性。結(jié)果表明大腸桿菌中達(dá)氟沙星耐藥基因oqxAB、aac(Ib-cr)、qnrAqnrB、qnrS和qepA基因的陽(yáng)性率在一定程度上隨著MIC值的升高而增大,qnrC和qnrD陽(yáng)性率為0。同樣,安普霉素耐藥基因aac(3)-Ⅳ和npmA的陽(yáng)性率也具有MIC值依賴(lài)性。采用微量肉湯稀釋法進(jìn)一步篩選到24株達(dá)氟沙星高度耐藥菌和16株安普霉素高度耐藥菌,并使用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)這兩類(lèi)菌株對(duì)17種抗革蘭氏陰性菌常用抗生素的敏感性,結(jié)果表明這兩類(lèi)菌株均具有多重耐藥性,最低10耐,最高達(dá)15～16耐。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)所有的達(dá)氟沙星耐藥菌株對(duì)阿莫西林、氨芐西林、萘啶酸、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、四環(huán)素和甲氧芐啶均表現(xiàn)出100%耐藥,而對(duì)阿米卡星和磷霉素相對(duì)較敏感。所有的安普霉素耐藥菌株對(duì)阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶和氟苯尼考均表現(xiàn)出100%耐藥。所有安普霉素耐藥菌株都對(duì)慶大霉素耐藥,而對(duì)阿米卡星和大觀霉素相對(duì)較敏感。(3)達(dá)氟沙星對(duì)大腸桿菌的藥效學(xué)臨界值(COPD)的建立構(gòu)建大腸桿菌感染雞動(dòng)物模型,單次口服給予達(dá)氟沙星5 mg/kg后,分別收集不同時(shí)間點(diǎn)健康組和感染組雞的血樣和4種腸段(十二指腸、空腸、回腸和盲腸)的腸液,并用高效液相色譜熒光法檢測(cè)藥物濃度。4種腸段的群體藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)符合二室模型。健康組雞從十二指腸、空腸到回腸的吸收速率(Ka)、清除率(CL)和分布體積(V)依次下降。而在感染組雞的腸道中,空腸中Ka和V值最高。與健康組相比,感染組雞從十二指腸、空腸到回腸,達(dá)氟沙星的CL依次降低,且均低于健康組雞的相應(yīng)腸段,十二指腸和回腸的Ka顯著降低,空腸和回腸中的V增大。健康組和感染組雞回腸中的F均較高。大腸桿菌078在MH肉湯、回腸液和血漿中的生長(zhǎng)曲線的趨勢(shì)一致。微量肉湯稀釋法檢測(cè)達(dá)氟沙星在肉湯、血漿和4種腸液中對(duì)大腸桿菌078的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果顯示,達(dá)氟沙星在MH肉湯和血漿中的MIC均為0.016μg/mL,而在4種腸液中MIC值均比血漿中和MH肉湯中的大,其中空腸液中的MIC值最大(6.4 μg/mL),而在回腸液中的MIC值最小(0.64 μg/mL)。采用平板傾倒計(jì)數(shù)法,繪制達(dá)氟沙星對(duì)大腸桿菌078的體外和半體內(nèi)(回腸和十二指腸)殺菌曲線。達(dá)氟沙星的體外和半體內(nèi)殺菌作用均表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性,因此可選擇PK/PD參數(shù)AUC/MIC來(lái)制定COPD。綜合血漿和4種腸段中達(dá)氟沙星的藥動(dòng)學(xué)(PK)和藥效學(xué)(PD)特點(diǎn),最終采用感染組回腸中的數(shù)據(jù)建立COPD。使用Winnonlin軟件分析血漿和回腸的PK數(shù)據(jù),得到達(dá)氟沙星在感染組雞血漿中的平均達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、達(dá)峰濃度(Cmax)和藥時(shí)曲線下面積(AUC24)分別為 1 h,0.38 μg/mL 和 2.06 h·μg/mL;在回腸中的 Tmax、Cmax和 AUC 分別為 2.7 h,18.95μg/mL和261.78 h·μg/mL。進(jìn)而用Winnonlin軟件中Sigmoid Emax模型對(duì)回腸的PK/PD數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬,選擇E=-3時(shí)AUC/MIC的值為藥效學(xué)目標(biāo)。計(jì)算得到達(dá)氟沙星在回腸中的藥效學(xué)目標(biāo)為421.45。最后使用Crystal ball軟件對(duì)達(dá)氟沙星在回腸中的PK/PD數(shù)據(jù)進(jìn)行蒙特卡洛模擬,得到不同MIC值下AUC/MIC達(dá)到藥效學(xué)目標(biāo)的概率,選擇達(dá)標(biāo)率大于90%的最大MIC為COPD。即回腸液中達(dá)氟沙星對(duì)大腸桿菌的COPD為0.54 μg/mL。(4)達(dá)氟沙星對(duì)大腸桿菌的臨床臨界值(COCL)的制定本研究中,達(dá)氟沙星對(duì)雞的臨床治療試驗(yàn)包括感染組、感染治療組和1個(gè)空白對(duì)照組,每組10只雞。攻毒菌株是通過(guò)PCR和雛雞攻毒實(shí)驗(yàn)篩選出的5個(gè)不同MIC值的大腸桿菌致病株。每一個(gè)感染組對(duì)應(yīng)三個(gè)感染治療組,治療方案分別為5 mg/kg,2次/天,連續(xù)3天;10mg/kg,2次/天,連續(xù)3天;20mg/kg,1次/天,連續(xù)3天。治療結(jié)果表明,3種治療方案的治愈率無(wú)明顯差異。因此,選擇5 mg/kg的治療結(jié)果來(lái)制定COCL。首先采用EUCAST推薦的WindoW法,得到達(dá)氟沙星對(duì)大腸桿菌的COCL范圍為0.5～16 μg/mL。然后用CART分類(lèi)樹(shù)回歸分析法分析得到,當(dāng)POC等于90%時(shí),COCL2.25μg/mL。因此,推薦4μg/mL為達(dá)氟沙星對(duì)大腸桿菌的COCL。綜上,本研究中達(dá)氟沙星的COWT=COcL=4μg/mL,COPD為0.54μg/mL。因此,達(dá)氟沙星的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)為4 μg/mL。而安普霉素的COWT為16 μg/mL,其藥效學(xué)和臨床臨界值還有待進(jìn)一步研究和確定。
【圖文】：

星對(duì)１３６９株雞消化道大腸桿菌的ＭＩＣ結(jié)果見(jiàn)表３－２，其抑菌濃度范圍為０．１２５？６４邋ｐｇ／ｍＬ，逡逑在此范圍內(nèi)，達(dá)氟沙星的ＭＩＣ呈雙峰分布，峰值分別為０．５邋（ｉｇ／ｍＬ和８邋ｊｉｇ／ｍＬ，其中ＭＩＣ為逡逑８邋ｐｇ／ｍＬ時(shí)細(xì)菌有２１５株，占１５．７％，分布最多，其柱狀分布圖如圖３－３所示。達(dá)氟沙星對(duì)雞逡逑消化道大腸桿菌的ＭＩＣ５０為４噸／ｍＬ

次結(jié)果基本無(wú)差異，結(jié)果可信。安普霉素對(duì)１３６４株雞消化道大腸桿菌的ＭＩＣ結(jié)果見(jiàn)表３－３，逡逑其抑菌濃度范圍為２邋￣邋２５６邋ｐｇ／ｍＬ，安普霉素在此范圍中呈單峰分布，峰值為ＭＩＣ邋＝邋８邋ｇｇ／ｍＬ，，逡逑此處細(xì)菌有８２８株，占６０．７％，分布最多，其柱狀分布圖見(jiàn)圖３－４。安普霉素對(duì)雞消化道大腸逡逑桿菌的邋ＭＩＣ５０邋為邋８ｐｇ／ｍＬ，ＭＩＣ９０Ｓｌ６邋嗎／ｍＬ。逡逑表３－３邋１３６４株大腸桿菌對(duì)安普霉素的ＭＩＣ分布逡逑Ｔａｂ．３－３邋ＭＩＣ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｐｒａｍｙｃｉｎ邋ａｇａｉｎｓｔ邋１３６４邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ逡逑安普霉素逡逑０．５邐１邐２邐４邐８邐１６邐３２邐６４邐１２８邐２５６邐＞２５６逡逑ＭＩＣ邋（ｎｇ／ｍＬ）逡逑菌株數(shù)邐０邐０邐３邐５５邐８２８邐２００邐１０邐５邐１邐７邐２５５逡逑百分比（％）邐０邐０邐０．２２邐４．０３邐６０．７邐１４．６６邐０．７３邐０．３７邐０．０７邐０．５１邐１８．７逡逑１０００－．逡逑８００－邐咬逡逑＾邐６００－邐§逡逑＿邐４００＿邐＾逡逑２００■邐｜邐ｒａ逡逑Ｊ，邐一＾３邋W，逡逑＾邐＼邐＾邐＾邋＾逡逑ＭＩＣ0ｉｇ／ｍＬ）逡逑圖３－４安普霉素對(duì)大腸桿菌ＭＩＣ分布直方圖逡逑Ｆｉｇ．３－４邋ＭＩＣ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａｐｒａｍｙｃｉｎ邋ａｇａｉｎｓｔ邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ逡逑２７逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S859.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2696802