本文關(guān)鍵詞：葉酸和蛋氨酸調(diào)控肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表觀遺傳機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：炎癥刺激引發(fā)的機(jī)體免疫反應(yīng),會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)素向免疫系統(tǒng)分配,從而影響肉雞的能量和蛋白質(zhì)代謝,降低肉雞采食量和生產(chǎn)性能。促炎性細(xì)胞因子的釋放在營(yíng)養(yǎng)素分配、炎癥發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用,表觀遺傳學(xué)修飾可調(diào)控特異基因(促炎性細(xì)胞因子)的表達(dá)。本研究分3個(gè)試驗(yàn),從利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)構(gòu)建肉雞外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)體外炎癥模型入手,分析促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)修飾,研究葉酸(folic acid,FA)和蛋氨酸(methionine,Met)對(duì)LPS刺激的促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)調(diào)控,以期為營(yíng)養(yǎng)表觀遺傳調(diào)控肉雞炎癥反應(yīng)提供理論依據(jù)。試驗(yàn)一LPS刺激對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響本試驗(yàn)通過(guò)研究LPS不同刺激時(shí)長(zhǎng)(0,3,6 h)和刺激濃度(0,5,10,15,20 mg/L)對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)表達(dá)的影響,建立肉雞PBMC體外炎癥模型。結(jié)果顯示LPS刺激時(shí)長(zhǎng)和劑量對(duì)三種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)均存在交互作用(P0.001);LPS刺激時(shí)長(zhǎng)為3 h時(shí),能顯著提高三種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量(P0.001);不同濃度的LPS均能顯著提高三種促炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量(P0.001),LPS為低濃度5 mg/L時(shí),IL-1β的表達(dá)量顯著高于其他組;LPS為較高濃度15 mg/L和20 mg/L時(shí),IL-6的表達(dá)量顯著高于其他組。在LPS刺激時(shí)長(zhǎng)為3 h時(shí),IL-1β表達(dá)量在刺激濃度為5 mg/L時(shí)最高;IL-6表達(dá)量在刺激濃度為20 mg/L時(shí)最高;TNF-α表達(dá)量在刺激濃度為10 mg/L時(shí)最高。因此,LPS刺激建立肉雞PBMC體外炎癥模型成功,選擇LPS刺激時(shí)長(zhǎng)為3 h,刺激濃度為10 mg/L。試驗(yàn)二LPS刺激對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子表觀遺傳學(xué)修飾的影響本試驗(yàn)采用BSP法和Dnase I-qPCR法檢測(cè)LPS刺激后肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化,并用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,AZA)和組蛋白去乙�；敢种苿┕徘志�(trichostatin A,TSA)研究促炎性細(xì)胞因子表達(dá)與DNA甲基化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系。結(jié)果顯示,LPS處理組顯著降低DNMT1(P0.05)和HDAC2(P0.05)的表達(dá)量,但顯著提高了PCAF和Tip60的表達(dá)量(P0.05)。LPS處理顯著降低了IL-6啟動(dòng)子區(qū)-264和-302 CpG位點(diǎn)的甲基化水平(P0.05),且顯著降低了TNF-α啟動(dòng)子區(qū)的總體甲基化(P0.05)和-371 CpG位點(diǎn)的甲基化水平(P0.05),但對(duì)IL-1β啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平無(wú)顯著影響。LPS處理顯著降低IL-1β和IL-6啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)構(gòu)象的緊密度(P0.05),但對(duì)TNF-α啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)構(gòu)象的緊密度無(wú)顯著影響。LPS處理顯著降低DNMT1,DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)量(P0.05);但AZA處理對(duì)DNMTs表達(dá)無(wú)顯著影響。LPS顯著提高IL-1β,IL-6和TNF-α的表達(dá)量(P0.05),且AZA/LPS處理組的IL-6和TNF-α表達(dá)顯著高于LPS處理組(P0.05)。TSA處理顯著降低了HDAC2,HDAC3,HDAC8和HDAC9的表達(dá)量(P0.05);LPS刺激顯著降低了HDAC2,HDAC3,HDAC7,HDAC8,HDAC9和HDAC10的表達(dá)量(P0.05);TSA/LPS處理顯著降低了HDAC2,HDAC3,HDAC8,HDAC9和HDAC10的表達(dá)量(P0.05)。LPS處理顯著提高了三種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)(P0.05);TSA/LPS的處理能顯著降低由LPS刺激引起的三種促炎性細(xì)胞因子的高表達(dá)(P0.05)。結(jié)果表明,LPS引起的IL-1β高表達(dá)與染色質(zhì)構(gòu)象有關(guān),IL-6高表達(dá)與DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象有關(guān),TNF-α高表達(dá)與DNA甲基化有關(guān),HDACi可作為可能的抗炎制劑。試驗(yàn)三葉酸和蛋氨酸對(duì)LPS刺激的肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳調(diào)控本試驗(yàn)通過(guò)分析肉雞PBMC增殖活性、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)、促炎性細(xì)胞因子表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化變化,研究葉酸和蛋氨酸對(duì)LPS刺激的肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。結(jié)果顯示,Met和FA對(duì)肉雞PBMC增殖活性存在交互作用(P0.001),Low-Met和Low-FA顯著抑制了肉雞PBMC的轉(zhuǎn)化率(P0.001),High-Met和High-FA顯著促進(jìn)了肉雞PBMC的增殖(P0.001)。Met和FA對(duì)肉雞PBMC DNMTs的表達(dá)存在交互作用;與Medium-Met相比,Low-Met顯著提高了DNMT1和DNMT3a的表達(dá)量,High-Met顯著降低了DNMT3a的表達(dá)量;與Medium-FA相比,Low-FA顯著提高了DNMT1,DNMT3a的表達(dá)量,且High-FA顯著提高了DNMT1的表達(dá)量。與Low-Met相比,High-Met顯著降低了IL-6的表達(dá)量(P0.05);Medium-Met顯著降低了TNF-α的表達(dá)量(P0.05);FA對(duì)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)無(wú)顯著影響。High-Met組極顯著提高IL-6-191 CpG位點(diǎn)甲基化水平(P0.001)。Medium-Met組顯著提高TNF-α-419 CpG位點(diǎn)甲基化水平(P0.05)。結(jié)果表明,Met可通過(guò)影響IL-6和TNF-α基因特異位點(diǎn)的甲基化水平,進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄水平,緩解炎癥反應(yīng)。本研究表明,LPS刺激引起的肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子高表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳學(xué)修飾改變相關(guān);Met可通過(guò)提高促炎性細(xì)胞因子啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平,降低其轉(zhuǎn)錄水平,緩解炎癥反應(yīng);FA對(duì)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)無(wú)影響。
【關(guān)鍵詞】：肉雞PBMC 促炎性細(xì)胞因子 DNA甲基化 蛋氨酸 葉酸
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1.1 炎癥13-15
• 1.1.1 炎癥反應(yīng)13-14
• 1.1.2 炎癥模型建立14
• 1.1.3 炎癥反應(yīng)機(jī)制14-15
• 1.2 營(yíng)養(yǎng)表觀遺傳學(xué)15-17
• 1.2.1 表觀遺傳學(xué)15-16
• 1.2.2 營(yíng)養(yǎng)表觀遺傳學(xué)16-17
• 1.3 炎癥的營(yíng)養(yǎng)表觀遺傳學(xué)調(diào)控17-20
• 1.3.1 DNA甲基化17-18
• 1.3.2 組蛋白修飾18-20
• 1.4 研究問(wèn)題的提出及研究?jī)?nèi)容20-22
• 1.4.1 研究問(wèn)題的提出20-21
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容21
• 1.4.3 技術(shù)路線21-22
• 第二章 LPS刺激對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響22-27
• 2.1 材料與方法22-25
• 2.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)22
• 2.1.2 試驗(yàn)材料與儀器22-23
• 2.1.3 細(xì)胞分離培養(yǎng)23
• 2.1.4 RT-qPCR法檢測(cè)相應(yīng)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量23-24
• 2.1.5 數(shù)據(jù)分析24-25
• 2.2 結(jié)果25-26
• 2.2.1 LPS刺激對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響25-26
• 2.3 討論26
• 2.4 小結(jié)26-27
• 第三章 LPS刺激對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子表觀遺傳學(xué)修飾的影響27-40
• 3.1 材料與方法27-32
• 3.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)27-28
• 3.1.2 試驗(yàn)材料與儀器28
• 3.1.3 BSP方法檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平28-30
• 3.1.4 Dnase I-qPCR方法檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)構(gòu)象30-31
• 3.1.5 RT-qPCR方法檢測(cè)相應(yīng)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量31-32
• 3.1.6 數(shù)據(jù)分析32
• 3.2 結(jié)果32-38
• 3.2.1 LPS刺激對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子DNA甲基化的影響32-34
• 3.2.2 LPS刺激對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子染色質(zhì)構(gòu)象的影響34
• 3.2.3 LPS刺激對(duì)肉雞PBMC表觀遺傳學(xué)相關(guān)酶表達(dá)的影響34
• 3.2.4 促炎性細(xì)胞因子啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)34-35
• 3.2.5 AZA對(duì)肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響35-36
• 3.2.6 TSA對(duì)肉雞PBMC組蛋白去乙�；讣按傺仔约�(xì)胞因子表達(dá)的影響36-38
• 3.3 討論38-39
• 3.4 小結(jié)39-40
• 第四章 葉酸和蛋氨酸對(duì)LPS刺激的肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)調(diào)控40-46
• 4.1 材料與方法40-41
• 4.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)40
• 4.1.2 試驗(yàn)材料與儀器40
• 4.1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性40-41
• 4.1.4 RT-qPCR方法檢測(cè)相應(yīng)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量41
• 4.1.5 BSP方法檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平41
• 4.1.6 統(tǒng)計(jì)方法41
• 4.2 結(jié)果41-44
• 4.2.1 葉酸和蛋氨酸對(duì)LPS刺激的肉雞PBMC增殖活性的影響41-42
• 4.2.2 葉酸和蛋氨酸對(duì)LPS刺激的肉雞PBMC DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響42-43
• 4.2.3 葉酸和蛋氨酸對(duì)LPS刺激的肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響43
• 4.2.4 葉酸和蛋氨酸對(duì)LPS刺激的肉雞PBMC促炎性細(xì)胞因子DNA甲基化的影響43-44
• 4.3 討論44-45
• 4.4 小結(jié)45-46
• 第五章 總體結(jié)論與建議46-47
• 5.1 本研究的主要結(jié)論46
• 5.2 有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 致謝53-54
• 作者簡(jiǎn)介54-55

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