【摘要】：炎性體是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物,它由模式識別受體(PRR)、半胱天冬酶-1(caspase-1)和含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋(apoptosis associated speck-like protein cotaining a CARD,ASC)組成。NOD-樣受體(Nod-like receptor,NLR)被激動劑激活,通過NOD受體導(dǎo)致寡聚化,借助嗜同型相互作用,組裝一個大的分子復(fù)合物作為平臺來招募Caspase-1前體,招募到炎癥復(fù)合體周圍后,Caspase-1自身裂解變?yōu)榫哂屑羟谢钚缘腃aspase-1,活化的Caspase-1能夠?qū)L-1β和IL-18前體剪切為成熟的IL-1β和IL-18,使達(dá)到它們穩(wěn)定且有活性的狀態(tài),促使其分泌至胞外,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。益生菌的益生功能之一是可以通過調(diào)控促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的平衡而緩解腸道炎癥反應(yīng)從而達(dá)到防病的作用。植物乳桿菌可以調(diào)節(jié)宿主腸道微生態(tài)的組成,調(diào)整菌群之間的關(guān)系,形成生物學(xué)屏障而發(fā)揮黏膜免疫功能。大量實驗資料表明植物乳酸桿菌可能在宿主抗感染、抗腫瘤免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。它能夠增強吞噬細(xì)胞功能、誘導(dǎo)細(xì)胞因子及一氧化氮等免疫介質(zhì)釋放。Nod-like receptor(NLR)家族成員在降低宿主對化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎方面發(fā)揮重要作用。本研究首先用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎疾病模型,然后用植物乳桿菌干預(yù)小鼠結(jié)腸炎模型,進(jìn)而闡明乳酸菌是否參與調(diào)控Pro-IL-1β/Pro-IL-18的釋放、誘導(dǎo)炎性體信號對其剪切、成熟并釋放調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的機制。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)NLRP6在植物乳桿菌干預(yù)小鼠結(jié)腸炎中的作用本實驗通過給C57B/L6小鼠自由飲用4%DSS建立急性結(jié)腸炎模型,探究植物乳桿菌對小鼠結(jié)腸炎的免疫調(diào)節(jié)功能,評價乳酸菌對DSS模型小鼠的防治作用。實驗結(jié)果表明,與DSS模型組相比,植物乳桿菌預(yù)防組和治療組,小鼠體重明顯升高,結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)(DAI)顯著下降,結(jié)腸長度變長,結(jié)腸組織微觀病理變化顯著緩解,腸系膜淋巴結(jié)(MLNs)中CD3~+CD4~+IL-4~+和CD3~+CD4~+IL-10~+T細(xì)胞水平升高,結(jié)腸組織中的IL-18升高,而IL-1β下降。在植物乳桿菌干預(yù)的過程中,NLRP6蛋白在結(jié)腸組織中表達(dá)增高,以上結(jié)果說明,DSS模型小鼠腸道炎性反應(yīng)增加,但乳酸菌可以在腸道內(nèi)通過激活NLRP6蛋白實現(xiàn)抑制IL-1β分泌、促進(jìn)IL-18分泌。在急性結(jié)腸炎模型中,植物乳桿菌激活的NLRP6蛋白發(fā)揮著重要的作用。(2)植物乳桿菌誘導(dǎo)NLRP6炎性體活化抗結(jié)腸炎機制研究為了進(jìn)一步揭示植物乳桿菌調(diào)節(jié)NLRP6蛋白發(fā)揮的生物學(xué)功能,體外實驗以原代C57B/L6小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞為研究模型,分析植物乳桿菌對NF-κB信號通路的影響,在LPS激活炎性體第一信號的情況下植物乳桿菌是否參與NLRP6炎性體的調(diào)控作用以及自噬信號和一氧化氮合成酶對炎性體信號的影響。通過免疫印跡、免疫熒光分析結(jié)果表明植物乳桿菌可以激活LC3II和一氧化氮合成酶。通過熒光定量PCR、免疫印跡、免疫熒光分析結(jié)腸組織中NLRP6表達(dá),實驗結(jié)果表明,經(jīng)過植物乳桿菌干預(yù)在結(jié)腸組織中NLRP6能夠大量表達(dá),主要表達(dá)于炎性細(xì)胞中。實驗結(jié)果表明,植物乳桿菌可以誘導(dǎo)NLRP6表達(dá),抑制IκBα磷酸化從而抑制的NF-κB表達(dá),通過LPS激活NLRP6炎性體第一信號后植物乳桿菌可以激活NLRP6炎性體,并對IL-1β成熟有一定的抑制作用,對IL-18進(jìn)行剪切并成熟釋放,且整個過程主要依賴于NLRP6信號。結(jié)果表明,植物乳桿菌胞壁成分肽聚糖可能是激活炎性體的活性物質(zhì)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可以誘導(dǎo)NLRP6炎性體的活化,進(jìn)而抑制IL-1β的分泌和增強IL-18的分泌,減緩了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)。該論文實驗結(jié)果初步揭示了乳酸菌緩解和治療小鼠結(jié)腸炎的分子免疫機制,具有重要的理論價值和應(yīng)用價值。
【圖文】：

1.2 結(jié)果1.2.1 DSS 結(jié)腸炎模型的建立隨機選取兩組體重均一致的 C57BL/6 小鼠，其中一組采取自由飲水的方式飼喂 4% DSS 七天， DSS 組小鼠在第四天體重已經(jīng)開始下降（圖 A）、DAI 在第三天開始升高（圖 B）、從肉眼也可以看出 DSS 組小鼠肛門處有血液凝固（圖 C），說明小鼠已經(jīng)發(fā)生血便、結(jié)腸組織 HE 染色數(shù)據(jù)(10×)（圖 D）顯示 DSS 組結(jié)腸黏膜不完整，腺體被破壞，腸壁增厚，說明 DSS 模型的成功構(gòu)建。

I 指數(shù)進(jìn)行記錄，如圖所示通過體重可以在一定程度上改善小鼠結(jié)腸炎的可以得出 L. plantarum NC8 能夠降低度（圖 C）可以看到 DSS 模型組的的緩解其癥狀。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

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本文編號：2694543