【摘要】：雞球蟲病是由一種或數種艾美耳球蟲寄生于雞消化道上皮細胞內引起的一種寄生原蟲病,嚴重危害養(yǎng)雞業(yè),在我國每年僅用于該病的防治費用就達3～6億元。長期以來,該病的防治主要依賴藥物。但隨著藥物的長期使用,引起耐藥性蟲株普遍出現,使藥物防治效果不斷下降。此外,抗球蟲藥在飼料中的長期添加,還導致藥物殘留肉蛋,污染環(huán)境,危害人類健康。因此,迫切需要尋找新的策略或方法來控制雞球蟲病。毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix)是7種雞球蟲中致病性最強的球蟲之一,主要危害8～18周齡的雞,引起急性小腸球蟲病。艾美耳球蟲的生活史包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三個發(fā)育階段,裂殖生殖又有不同的繁殖代數。一般認為艾美耳球蟲的生長發(fā)育與性別分化受制于不同發(fā)育階段的基因差異表達與調控。球蟲各階段蟲體的分離純化很難,因此也制約了球蟲分子生物學研究領域的發(fā)展。艾美耳球蟲發(fā)育的相關研究國內外文獻報道很少,尤其是有關毒害艾美耳球蟲的不同發(fā)育階段的分子學研究國內外尚無有關報道。毒害艾美耳球蟲的裂殖生殖包括三代,第一、二代裂殖生殖發(fā)生在小腸中段的腸黏膜上皮細胞內,第三代裂殖生殖和配子生殖發(fā)生在盲腸黏膜上皮細胞內,易于蟲體鑒別與分離。本文分離與純化了毒害艾美耳球蟲的第二、三代裂殖子和配子體,提取總RNA后采用第二代測序技術分別對這3個發(fā)育階段蟲體的mRNA進行測序,獲得轉錄組數據;對轉錄組數據進行比較分析,篩選不同發(fā)育階段蟲體的差異表達基因,并進行實時定量PCR驗證、功能注釋與代謝通路富集分析;最后,對4個差異表達基因進行原核表達與免疫熒光定位,對其中1個重組蛋白進行了動物免疫保護試驗。本文通過毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子和配子體3個發(fā)育階段的轉錄組測序和比對分析,獲得了3個發(fā)育階段的差異表達基因,而對艾美耳球蟲不同發(fā)育階段差異表達基因的研究,不僅可以解析艾美耳球蟲生長發(fā)育的的分子基礎與機制,而且可能尋找到藥物或疫苗免疫的靶點,從而為雞球蟲病的防治提供新途徑和新方法。一、毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子和配子體的分離與純化用毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊經嗉囊接種無球蟲感染雛雞后,從雞小腸中段黏膜組織中分離第二代裂殖子,最后采用Percoll密度梯度離心法純化裂殖子,平均每只雞獲得7.25×108個裂殖子;從雞盲腸黏膜組織中分離第三代裂殖子,最后采用DEAE-52纖維素柱層析法純化裂殖子,平均每只雞獲得0.6×107個裂殖子。通過外科手術經盲腸直接接種第二代裂殖子后30 h,從雞盲腸黏膜組織中分離配子體,最后采用Percoll密度梯度離心法純化配子體,平均每只雞獲得0.5×108個配子體。二、毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子與配子體的轉錄組分析分別提取毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子和配子體的RNA,構建測序樣本文庫,進行高通量測序。分別從第二代裂殖子文庫、第三代裂殖子文庫和配子體文庫中獲得68009 332,51 854 332,73 219 844條Raw reads。比對后,第二代裂殖子共有6 977個基因注釋成功,第三代裂殖子有6 901個基因注釋成功,配子體有7983個基因注釋成功�；虻谋磉_分析顯示,7 137個基因在3個階段均有表達,71個基因僅在第二代裂殖子表達,61個基因僅在第三代裂殖子表達,340個基因僅在配子體表達。GO分析顯示在3個發(fā)育階段基因富集的GO條目數相近,僅在條目中的基因數有所不同。KEGG分析顯示3個階段的通路有所不同,第二代裂殖子的基因主要參與剪接體、核糖體、的合成、蛋白酶體、DNA復制、RNA轉運等通路;第三代裂殖子的基因主要參與剪接體、核糖體合成、RNA轉運、RNA降解、RNA聚合酶等;配子體的基因主要參與核糖體的合成、HIF-1信號通路、剪接體、突觸囊泡循環(huán)、溶酶體、磷酸戊糖途徑等。三、毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子比較轉錄組學分析比較分析每個轉錄本在第二代裂殖子和第三代裂殖子的表達量,發(fā)現2 053個基因表達顯著差異,其中第二代裂殖子顯著上調表達基因1 216個,特異性表達基因95個;第三代裂殖子顯著上調表達基因837個,特異性表達基因48個。GO分析顯示中有1 203個差異表達基因被成功注釋到59個GO條目,GO富集分析中有1 091個差異表達基因富集在243個GO條目。KEGG分析顯示,620個差異表達基因被成功注釋到198條信號通路,727個差異表達基因富集到242條信號通路。四、毒害艾美耳球蟲第三代裂殖子與配子體比較轉錄組學分析比較分析每個轉錄本在第三代裂殖子和配子體的表達量,發(fā)現4 267個基因表達顯著差異,其中第三代裂殖子顯著上調表達基因1 478個,特異性表達基因329個;第三代裂殖子顯著上調表達基因2 789個,特異性表達基因1 289個。差異表達基因的GO分析顯示,1 295個被成功注釋到57個GO條目。KEGG分析顯示,620個差異表達基因被成功注釋到198條信號通路。富集分析顯示,725個顯著差異表達基因富集到241條信號通路。五、差異表達基因的原核表達及免疫熒光定位分析根據熒光定量PCR的驗證結果,選擇4個差異表達基因(EnPIPK、En4GC、EnCK2、EnHAP2),人工合成或應用RT-PCR方法克隆基因序列,并分別用原核表達載體pET28a(+)構建表達質粒,轉化大腸桿菌BL21,誘導表達。融合蛋白的大小分別為30 kDa、17kDa、20 kDa、20kDa左右,均以包涵體的形式存在為主。Western blot檢測顯示,4種重組蛋白均能識別抗6×HIS標簽單抗。分別用4種重組蛋白免疫小鼠制備的多抗進行免疫免疫熒光定位試驗,結果顯示EnPIPK、EnCK2和EnHAP2基因表達產物定位在第二代裂殖子(或裂殖子體)、第三代裂殖子(或裂殖體)和配子體,但在3個發(fā)育階段表現的熒光強度不盡一致;EnAGC基因表達產物僅見于第三代裂殖子(或裂殖體)和配子體。免疫免疫熒光定位與熒光定量PCR結果相一致。六、重組蛋白rEnHAP2免疫保護效果將純化復性的重組蛋白rEnHAP2按不同劑量(200、100、50μg/羽)免疫無球蟲感染雛雞,免疫2次后除未免疫未攻蟲組外,其余各試驗組雛雞均感染毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊,以成活率、卵囊減少率、病變記分、平均增重等為指標,評價重組蛋白的免疫保護效果,并檢測其誘導的細胞因子的表達水平。試驗共進行2次。結果顯示,rEnHAP2以每雞200 μg的免疫劑量保護效果最好,與未免疫攻蟲組相比,重組蛋白rEnHAP2能降低卵囊產量與病變記分,提高存活率;能誘導機體產生較高水平的細胞免疫和體液免疫。
【圖文】：

宿世杰：毒害艾美耳球蟲３個發(fā)育階段的比較轉錄組學研宄與差異表達基因的克隆表達和功能鑒定邐３７逡逑現配子體純度高（圖１－３），，計數每只雞大約獲得０．５ｘｌ0８個蟲體。通過盲腸體外接種第逡逑二代裂殖子的方法不僅解決了發(fā)育的不同步性，而且大大增加了配子體的數量和密度。逡逑＞、心邋￥邐兔、…＇邋＜，邐備，邐《逡逑＿畫＿

本文編號：2690829