【摘要】：狂犬病病毒(RABV)是具神經(jīng)嗜性的高度致死性人獸共患傳染性病原,感染機(jī)體可引起神經(jīng)性腦脊髓炎,臨床表現(xiàn)出恐水、怕風(fēng)、肌肉痙攣等癥狀,死亡率高達(dá)100%。RABV病毒粒子由5種結(jié)構(gòu)蛋白組成,分別為核蛋白(N)、磷蛋白(P)、糖蛋白(G)、基質(zhì)蛋白(M)和依賴RNA的RNA多聚酶(L);其中N、P、L組成核糖核蛋白復(fù)合體(RNP),在RABV復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中起著非常關(guān)鍵的作用;G負(fù)責(zé)識別細(xì)胞膜上受體并介導(dǎo)病毒的胞內(nèi)運(yùn)輸過程,在RABV入胞過程中的作用十分重要。細(xì)胞內(nèi)吞是通過細(xì)胞質(zhì)膜的變形運(yùn)動將細(xì)胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的過程。不僅蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)借用此過程進(jìn)入細(xì)胞,許多有囊膜病毒也通過內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)其對宿主的感染。網(wǎng)格蛋白是最為常見的一種內(nèi)吞標(biāo)志蛋白,其介導(dǎo)多數(shù)大分子物質(zhì)的入胞過程;小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑在物質(zhì)入胞過程中同樣起重要作用,其中小窩蛋白1是小窩的標(biāo)志性蛋白,而膽固醇在維持小窩的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性作用中十分關(guān)鍵,因此細(xì)胞中小窩蛋白1表達(dá)量和膽固醇含量是衡量小窩功能的一個重要標(biāo)志。本研究首先利用蛋白酶k處理的方法,選取接毒孵育的不同時間點(diǎn)加入蛋白酶k并收集細(xì)胞,確定RABV感染N2a細(xì)胞的入胞時間;隨后以網(wǎng)格蛋白和小窩依賴性內(nèi)吞方式為出發(fā)點(diǎn),在N2a細(xì)胞中,加入網(wǎng)格蛋白特異性抑制劑氯丙嗪、膽固醇抽提劑制霉菌素和甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)、發(fā)動蛋白特異性抑制劑dynasore和囊泡酸化特異性抑制劑巴佛洛霉素a1處理細(xì)胞后感染RABV。采用RT-q PCR及western blot方法檢測RABV N的表達(dá)量;通過免疫熒光方法觀察藥物處理后RABV在N2a細(xì)胞中的感染率;隨后采用基因沉默手段下調(diào)N2a細(xì)胞中網(wǎng)格蛋白重鏈及小窩蛋白1的表達(dá)水平,并采用RT-q PCR和western blot方法檢測RABV N基因拷貝數(shù)和N蛋白表達(dá)水平。為驗證RABV在不同細(xì)胞系中的入胞途徑,本研究還在SH-SY5Y和Vero細(xì)胞中加入上述抑制劑后感染RABV,采用RT-q PCR方法檢測RABV N基因拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,在2h時大約95%病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞。隨后觀察到,經(jīng)氯丙嗪、dynasore、巴佛洛霉素a1處理的N2a細(xì)胞感染RABV后,隨藥物濃度增大,與對照組相比,細(xì)胞中RABV N基因拷貝數(shù)及N蛋白的表達(dá)水平均呈劑量依賴性下降趨勢;免疫熒光檢測結(jié)果顯示,藥物處理后,N蛋白熒光數(shù)量與對照組相比顯著減少。然而制霉菌素和MβCD處理N2a細(xì)胞后,細(xì)胞中RABV N基因拷貝數(shù)和N蛋白表達(dá)量與對照組相比無顯著差異。隨后下調(diào)網(wǎng)格蛋白重鏈的表達(dá)后,RABV N基因拷貝數(shù)和N蛋白表達(dá)水平與對照組相比均顯著降低,而下調(diào)小窩蛋白1的表達(dá)后,RABV N基因拷貝數(shù)和N蛋白表達(dá)量與對照組相比均無顯著差異。在SH-SY5Y和Vero細(xì)胞中加入氯丙嗪、dynasore、巴佛洛霉素a1后RABV N基因拷貝數(shù)與對照組相比也顯著下降,而加入制霉菌素后RABV N基因拷貝數(shù)與對照組相比無顯著差異,此結(jié)果與N2a細(xì)胞中的檢測結(jié)果一致。以上結(jié)果表明,RABV需要約2小時完成對N2a細(xì)胞的感染。且RABV進(jìn)入N2a細(xì)胞不依賴于小窩內(nèi)吞途徑,而依賴于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)、發(fā)動蛋白剪切作用和內(nèi)吞體的酸化作用,而在SY5Y和Vero細(xì)胞中初步驗證結(jié)果與N2a細(xì)胞中一致,表明RABV進(jìn)入不同細(xì)胞系的入胞途徑可能相一致。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究狂犬病病毒感染不同細(xì)胞系的相應(yīng)機(jī)制和針對RABV入胞的藥物靶點(diǎn)研究提供了新的數(shù)據(jù)。
【圖文】：

第一篇 文獻(xiàn)綜述 第二章 病毒入胞機(jī)制研究進(jìn)展泡與胞膜脫離機(jī)制的體外研究已十分清晰，但其在體內(nèi)發(fā)揮作用是如何被調(diào)控以及它在體內(nèi)真正的作用機(jī)理目前仍然沒有明確結(jié)論[50-52]，仍有待進(jìn)一步研究。多數(shù)病毒利用一種或多種細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，病毒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞可以使其逃避細(xì)胞膜對外來入侵物質(zhì)的阻隔作用而順利到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中。大多數(shù)依賴內(nèi)吞入胞的病毒利用了上百種胞質(zhì)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，隨后由膜泡運(yùn)輸系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至各個細(xì)胞器。如圖 2.1[4]所示，病毒可以利用多種內(nèi)吞機(jī)制來促使自身進(jìn)入細(xì)胞，其中網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式被多數(shù)病毒所利用。

2.2 小窩蛋白介導(dǎo)的病毒內(nèi)吞機(jī)制由小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞方式的一個典型標(biāo)志，是早期內(nèi)吞體的形成依賴于膽固醇、脂筏和一系列包含酪氨酸激酶、磷酸酶的復(fù)雜信號通路[64]，，此過程由配體觸發(fā)，是細(xì)胞內(nèi)吞途徑中的一個重要過程。組成小窩的小窩相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)組成復(fù)合體，它們在體外可以進(jìn)行相互作用并與細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)[65, 66]；利用蔗糖密度梯度離心的方法可以將組成小窩蛋白復(fù)合體的相關(guān)蛋白彼此分離[67]，最近 LudwigA 等[68]研究發(fā)現(xiàn)，Hela 細(xì)胞中表達(dá)的組成小窩的相關(guān)蛋白通過分離可以得到一個 80S 復(fù)合體，如圖 2.2 所示，此復(fù)合體的分子組成可以表示為12 個 caveolin：3 個 cavin 1：1 個 cavin 2 或 cavin 3。其中 cavin 1 參與核糖體RNA 的合成過程，并且在細(xì)胞核內(nèi)參與基因的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程[69]；而小窩蛋白1（caveolin-1）則在細(xì)菌中可以獨(dú)立完成細(xì)胞膜囊泡的形成[70]，參與許多重要生理過程。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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2 姚鵬程,葉恭銀;網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用機(jī)制[J];生命科學(xué)研究;2003年S1期

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1 楊玉姣;狂犬病病毒靶向RNA干擾制劑的研制與鑒定研究[D];吉林大學(xué);2013年

本文編號：2678585