發(fā)布時間：2020-05-22 23:01

【摘要】：目前,研究表明,miR-148a-3p可以調(diào)控前體脂肪細胞的分化以及脂質的形成;PTEN可以通過抑制PI3K-AKT信號通路抑制前體脂肪細胞分化;PTEN是miR-148a-3p的一個潛在的靶基因。本試驗旨在建立體外家兔誘導分化模型以及驗證miR-148a-3p可以靶向PTEN調(diào)控家兔前體脂肪細胞成脂分化。試驗結果如下:(1)miR-148a-3p在5月齡家兔腎周脂肪組織中的表達量極顯著高于初生仔兔(P0.01);(2)成功分離家兔前體脂肪細胞,雞尾酒法誘導成脂分化后,油紅O染色發(fā)現(xiàn)第二天出現(xiàn)大量的小脂滴,第六天開始出現(xiàn)脂滴的匯聚,第十天時,脂滴明顯增多,且大脂滴也明顯增多,出現(xiàn)成熟脂肪細胞的特征。標志基因測定發(fā)現(xiàn),符合前體脂肪細胞分化規(guī)律。隨著前體脂肪細胞分化時間的推移,miR-148a-3p的表達量呈逐漸上調(diào)的趨勢;(3)轉染miR-148a-3p類似物mimic后,細胞內(nèi)miR-148a-3p的表達顯著上調(diào)(P0.01)。誘導前體脂肪細胞分化,結果顯示mimic可以促進前體脂肪細胞分化,脂肪細胞分化標志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4基因的mRNA水平均顯著上升(P0.05),脂肪酸和甘油三酯的含量極顯著增加(P0.01)。轉染miR-148a-3p抑制劑inhibitor,細胞內(nèi)miR-148a-3p的表達顯著下調(diào)(P0.05)。誘導前體脂肪細胞分化,結果顯示inhibitor可以抑制前體脂肪細胞分化,標志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4基因的mRNA水平均顯著降低(P0.05),脂肪酸和甘油三酯的含量極顯著降低(P0.05)。(4)生物信息學預測結果發(fā)現(xiàn),PTEN基因是miR-148a-3p的一個潛在的靶基因,且有兩個結合位點。雙熒光素酶報告試驗發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p可以作用PTEN基因的其中一個位點(P0.01),另一個結合位點并無靶向關系。(5)過表達miR-148a-3p后,可以下調(diào)PTEN基因mRNA和蛋白質的表達水平(P0.01)。抑制表達miR-148a-3p后,可以上調(diào)PTEN基因mRNA和蛋白質的表達水平(P0.05)。(6)抑制家兔前體脂肪細胞內(nèi)源性PTEN基因的表達量,PTEN表達量下降了約60%,可以促進細胞成脂分化,上調(diào)脂肪酸的合成,甘油三脂的含量,分化相關基因C/EBPα、PPARγ和FABP4基因的mRNA水平均顯著上升(P0.05),與過表達miR-148a-3p實驗結果一致。綜上所述,體外家兔誘導分化模型建立成功,且在家兔前體脂肪細胞分化過程中,miR-148a-3p可以通過靶向PTEN基因促進家兔前體脂肪細胞分化。
【圖文】：

8a-3p 在不同日齡家兔腎周脂肪中的表達水平（“*”表示 P≤示 P≤0.01；“***”表示 P≤0.005；“****”表示 P≤0.001）iR-148a-3p expression in perirenal fat of rabbits of differentP≤0.05; "**", P ≤0.01; "***", P ≤0.005; "****", P ≤ 0.001)體脂肪細胞的分離培養(yǎng)兔處死后，用酶消化法分離家兔前體脂肪細胞。接圓球狀漂浮在培養(yǎng)液中。接種 24h 后，大部分細胞已 后，細胞數(shù)量變多，形態(tài)更加穩(wěn)定，呈現(xiàn)出梭形、三別細胞細胞核周圍圍繞一圈呈花環(huán)狀的脂滴（圖 2，細胞數(shù)量不斷增多，細胞密度明顯增大，前體脂肪列(圖 2-C，圖 2-D)。結果表明前體脂肪細胞分離培

圖 2 家兔原代前體脂肪細胞的分離與培養(yǎng) （A）24h（100X）；（B）48h（200X）；（C）72h（100X）；（D）120h（100X）。Fig. 2, Isolation and culture of rabbit primary precursor adipose cells (A) For 24 hours(100X); (B) For 48 hours (200X); (C) For 72 hours (100X); (D) For 120 hours (100X)3.3 家兔原代前體脂肪細胞成脂分化模型建立取凍存于液氮中的家兔原代前體脂肪細胞復蘇、培養(yǎng)，待前體脂肪細胞密度達到 70%-80%時，用雞尾酒法誘導家兔前體脂肪細胞分化。并觀察細胞生長、分化狀態(tài)。結果如圖 3-A 所示，由于接觸抑制生長，細胞開始進入分化狀態(tài)，少部分細胞已經(jīng)開始分化，并出現(xiàn)少量的橘紅色脂滴，少數(shù)細胞內(nèi)出現(xiàn)花環(huán)狀脂滴，均勻的分散在整個培養(yǎng)皿中。原代前體脂肪細胞誘導分化 2 天后，染色后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)皿中橘紅色脂滴顯著增多，，變大，花環(huán)狀脂滴變多。原代前體脂肪細胞誘導分化 6 天后，培養(yǎng)皿中脂滴顯著增多，細胞內(nèi)的脂滴慢慢融合變大。原代前體脂
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S829.1

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本文編號：2676749