【摘要】：T細胞免疫應答在宿主抵抗胞內病原感染過程中扮演重要角色,同時對B細胞的效應功能發(fā)揮重要的調節(jié)作用。T細胞完全活化不僅依賴于MHC-抗原肽-TCR介導的抗原特異性信號,還需要CD28和4-1BB等分子介導的共刺激信號。增強第二信號可以降低T細胞活化時對第一信號的需求,即降低T細胞活化的閾值。一旦缺失第二信號,T細胞將出現反應無能從而導致病原逃避宿主的免疫防御。目前,靶向共刺激信號分子如CTLA-4和PD-1的免疫治療已取得重大突破。鑒于我國養(yǎng)豬業(yè)頻繁遭受各種傳染性疾病的侵襲,提高豬群的抗病能力無疑是一種快速而有效的解決手段。在本研究中,我們擬通過轉基因技術高表達豬共刺激分子CD28和4-1BB來增強疫苗的免疫效果,從而提升豬群的抗病能力�；贑RISPR/Cas9介導的基因編輯分別將目的基因CD28或4-1BB定點整合到豬胎兒成纖維細胞的Rosa26位點,獲得2株CD28轉基因細胞系和4株4-1BB轉基因細胞系,利用體細胞核移植技術制備轉基因豬,成功獲得5頭F0代CD28轉基因豬和3頭F0代4-1BB轉基因豬。鑒定結果顯示,CD28和4-1BB均定點整合到預期位點,且能穩(wěn)定表達,二者的mRNA水平分別高于同窩陰性仔豬。此外,血常規(guī)及生化指標顯示CD28或4-1BB轉基因對仔豬的生理健康無副作用。為驗證高表達CD28和4-1BB能否增強疫苗的免疫保護效果,本研究以豬繁殖與呼吸綜合征病毒為模型,分別在疫苗免疫和攻毒后,檢測T細胞介導的免疫應答水平。結果發(fā)現,CD28轉基因豬T細胞活化水平明顯升高,而4-1BB為誘導性表達,對維持T細胞的增殖發(fā)揮重要作用。免疫后28天,CD28轉基因豬CD4 T細胞的比例(26.03 ± 1.28%)顯著高于野生型豬(21.57 ± 0.91%,P=0.046),其病毒中和抗體水平為野生型豬的2倍。50倍劑量的疫苗毒株攻毒后10天,轉基因豬的臨床癥狀較輕。轉基因豬中和抗體滴度仍維持較高水平,CD8T細胞分泌IFN-y能力顯著增強,血清中的病毒載量顯著降低(P=0.02)。而4-1BB轉基因對PRRSV抗體水平無顯著影響,但可以促進Th1型細胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α的分泌。進一步CTL體外殺傷試驗結果顯示,4-1BB轉基因顯著增強CTL對PRRSV感染靶細胞的殺傷效應。為探究CD28轉基因對宿主抗感染能力的影響,我們以弓形蟲Toxoplasma gondii為病原模型,檢測感染后T細胞介導的適應性免疫應答特征。結果發(fā)現,與野生型豬相比,CD28轉基因豬抗弓形蟲感染的適應性免疫應答無顯著差異,但其肝臟、肌肉等組織中的載蟲量明顯降低。該結果表明,CD28轉基因豬具有一定的抗弓形蟲感染的能力,但其具體機制仍需進一步研究。綜上,本研究獲得了定點整合且能穩(wěn)定表達一額外拷貝的CD28或4-1BB轉基因豬,揭示了兩種共刺激分子均可以促進T細胞的效應功能,提升疫苗免疫效果和宿主的抗感染能力,為我國抗病育種事業(yè)提供了廣譜抗病基因和新的研究策略。
【圖文】：

實驗室前期己成功獲得ＣＤ２８和４－１ＢＢ兩種啟動子，并驗證了其調控效率。逡逑我們以ＰＢＭＣｃＤＮＡ為模板，ＰＣＲ擴增獲得ＣＤ２８和４－１ＢＢ的編碼序列，并融合Ｆｌａｇ標簽，逡逑電泳檢測目的片段大小。結果顯示，ＣＤ２８／Ｆｌａｇ和４－ｌＢＢ／Ｆｌａｇ大小分別為６８４ｂｐ和７５０ｂｐ（如圖２－３Ａ逡逑和Ｂ所示）。逡逑本研宄通過ｏｖｅｒｌａｐ邋ＰＣＲ方法分別將ＣＤ２８或４－１ＢＢ的啟動子，，ＣＤ２８或４－１ＢＢ的ＣＤＳ序逡逑列（Ｃ端融合Ｆｌａｇ標簽），ＣＤ２８或４－１ＢＢ的３’ＵＴＲ串連，分別得到ＣＤ２８或４－１ＢＢ表達框，并在逡逑兩個表達框上下游引入酶切位點，上游為ＥｃｏＲＶ，下游為ＡｓｃＩ和Ｋｐｎｌ。逡逑經電泳檢測，ＣＤ２８表達框大小為３．８邋ｋｂ，邋４－１ＢＢ表達框大小為４．４邋ｋｂ，均與預期相符（如圖逡逑３０逡逑

利用已公布的豬０ＣＴ４調控序列，設計引物，以成纖維細胞系ＹＫＸ００１基因組ＤＮＡ為模板，逡逑擴增ＯＣＴ４啟動子，同時在５’端引入ＬｏｘＰ序列和Ｋｐｎｌ酶切位點。逡逑電泳檢測目的片段大小接近３．４邋ｋｂ，與預期相符（如圖２－４Ａ所示）。回收ＰＣＲ產物，連Ｔ載逡逑體。小提質粒，利用Ｋｐｎｌ、Ｎｄｅｌ和ＲｓｒＩＩ三種內切酶進行酶切鑒定，條帶大小與預期相符，測序逡逑正確（如圖２－４Ｂ所示）。逡逑３１逡逑
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 郭頌;;轉基因豬技術在農業(yè)中的應用價值[J];國外畜牧學(豬與禽);2018年06期

2 曾芳;李紫聰;董銳;吳珍芳;王

本文編號：2674153