發(fā)布時(shí)間：2020-05-20 12:54

【摘要】：近年來(lái),畜牧行業(yè)發(fā)展迅速,導(dǎo)致飼料資源越來(lái)越匱乏,人畜爭(zhēng)糧問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重,飼料資源已成為阻礙養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的一個(gè)重大問(wèn)題。然而有一類主要成分為木質(zhì)纖維素的農(nóng)作物副產(chǎn)品資源十分豐富,但是這類含有木質(zhì)纖維素的植物,因其細(xì)胞壁難以降解,造成了自然界中大量的纖維素資源沒(méi)有在畜牧行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用,甚至造成環(huán)境污染。將木質(zhì)纖維素分解為可以被消化吸收的營(yíng)養(yǎng)成分,依賴于纖維素酶系對(duì)底物的協(xié)同降解。本論文圍繞產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的篩選,纖維素酶基因的克隆,枯草芽孢桿菌信號(hào)肽的系統(tǒng)性篩選,纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶和木聚糖酶的分泌表達(dá),以及多酶協(xié)同與多酶復(fù)合體協(xié)同降解天然纖維素效果進(jìn)行了研究。結(jié)果如下:1采用剛果紅染色法從腐殖質(zhì)中分離獲得一株產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌(Bacillus sp),經(jīng)革蘭氏染色和16s rDNA序列比對(duì)分析,分離獲得的芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),將其命名為B.subtili ZC-5。B.subtili ZC-5培養(yǎng)24 h產(chǎn)酶活性最高達(dá)到3.22U/mL。B.subtili ZC-5的纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為50℃-60℃,最適pH為pH6-pH7。該酶不耐受高溫。不同纖維來(lái)源對(duì)B.subtili ZC-5產(chǎn)纖維素酶活力有影響,培養(yǎng)基中添加燕麥青干草時(shí)B.subtili ZC-5纖維素酶活最高(4.21U/mL)。2從B.subtili ZC-5基因組DNA中克隆獲得纖維素內(nèi)切酶基因cen ZC-5。cen ZC-5全長(zhǎng)1.5 kb,編碼55個(gè)氨基酸,其編碼蛋白的N端30個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。cen ZC-5的序列與Bacillus subtilis纖維素內(nèi)切酶基因序列的相似性達(dá)到94%,cen ZC-5編碼蛋白與Bacillus subtilis的纖維素內(nèi)切酶具有很高的相似性。在大腸桿菌中進(jìn)行cen ZC-5原核表達(dá),驗(yàn)證了該基因編碼蛋白的纖維素酶活性。3構(gòu)建了E.coli-B.subtilis穿梭質(zhì)粒載體pCBS。基于pCBS和木聚糖酶基因xynBYG,分別構(gòu)建獲得信號(hào)肽篩選載體pP43-xynBYG和pPglvm-xynBYG。從B.subtilis1A747基因組中擴(kuò)增獲得138個(gè)信號(hào)肽編碼基因,獲得114個(gè)信號(hào)肽篩選表達(dá)載體pGS-pGS 114、114個(gè)信號(hào)肽篩選表達(dá)載體pP43S1-pP43S114、24個(gè)信號(hào)肽篩選表達(dá)載體pGT1-pGT24和24個(gè)信號(hào)肽篩選表達(dá)載體pP43T1-pP43T24。以B.subtilis WB700為宿主進(jìn)行276個(gè)信號(hào)肽介導(dǎo)的分泌表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果顯示,信號(hào)肽Sec途徑信號(hào)肽PhoB、YhfM,YpjP和CotC展現(xiàn)了高分泌表達(dá)水平,木聚糖酶酶活高于150 U/mL。含Tat途徑信號(hào)肽的分泌表達(dá)重組菌中,信號(hào)肽LipA的酶活最高,大部分Tat途徑信號(hào)肽的酶活低于0.1 U/mL。4對(duì)信號(hào)肽的氨基酸殘基性質(zhì)和相應(yīng)分泌表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,氨基酸疏水性、螺旋傾向性指數(shù)、螺旋含量指數(shù)、側(cè)鏈θ角度指數(shù)、螺旋穩(wěn)定性指數(shù)、氨基酸殘基跨膜指數(shù)、雙氨基酸殘基轉(zhuǎn)角傾向指數(shù)和信號(hào)肽D-score等指標(biāo)和分泌表達(dá)量呈強(qiáng)相關(guān)性。LPS分析顯示,7個(gè)氨基酸指數(shù)和信號(hào)肽D-score對(duì)分泌表達(dá)量變異的貢獻(xiàn)率為23%,其中螺旋傾向性指數(shù),氨基酸殘基跨膜指數(shù)和D-score是3個(gè)重要的獨(dú)立變量。采用同樣的分析方法分析這8個(gè)變量(7個(gè)氨基酸指數(shù)和信號(hào)肽D-score)和角質(zhì)酶分泌表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示,這8個(gè)變量對(duì)角質(zhì)酶分泌表達(dá)量變異的貢獻(xiàn)率為18%,氨基酸殘基跨膜指數(shù)和D-score是2個(gè)重要的獨(dú)立變量。PLS預(yù)測(cè)的模型和木聚糖酶表達(dá)量的測(cè)定值之間具有強(qiáng)相關(guān)性(PCC=0.54)。5構(gòu)建了含自身信號(hào)肽的cen ZC-5分泌表達(dá)載體pCEN,phoB介導(dǎo)的cen ZC-5分泌表達(dá)載體pPhoB-CEN。合成Clostridium thermocellum多酶復(fù)合體中纖維素酶組分的錨定域蛋白(Dockerin)的編碼基因Ctdoc,構(gòu)建3’端嵌合Ctdoccen的重組基因cenZC-5doc,并構(gòu)建了cenZC-5doc分泌表達(dá)載體pCENdoc。分泌表達(dá)檢測(cè)顯示,在12h、24h、36h和48h,B.subtilis WB700(pPhoB-CEN)的分泌表達(dá)水平依次是WB700(pCEN)的1.56、1.44、1.37和1.25倍。B.subtilis WB700(pCendoc)在24h和36h的分泌表達(dá)水平依次是B.subtilis WB700(pPhoB-CEN)的84.68%和8427%。6合成嵌合了Clostridium cellulolyticum纖維素Dockerin的編碼基因Ccdoc的重組纖維素外切酶cbhAdoc,并構(gòu)建分泌表達(dá)載體pCBdoc。構(gòu)建嵌合了Rumincoccus flavefaciens Dockerin的編碼基因Rfdoc的重組木聚糖酶xyn BYGdoc,并構(gòu)建分泌表達(dá)載體pXYNdoc。設(shè)計(jì)合成含Clostridium thermocellum纖維素結(jié)合域(CBM)和粘附域(Cohesin),Clostridium cellulolyticum Cohesin和Rumincoccus flavefaciens Cohesin的腳手架蛋白(Scaffoldin)基因scafCCR,并構(gòu)建分泌表達(dá)載體pScaf。分泌表達(dá)檢測(cè)顯示,cbhAdoc在B.subtilis WB700中的分泌表達(dá)水平在24h達(dá)到最大為1.59U/mL。重組木聚糖酶Xyn BYGdoc在24h的分泌表達(dá)水平達(dá)到最大為302.11U/mL。在24h和48h,重組木聚糖酶(xyn BYGdoc)的分泌表達(dá)量為木聚糖酶(xyn BYG)的81.56%和76.24%。7為檢測(cè)不同酶協(xié)同降解效果,采用B.subtilis WB700分泌表達(dá)的CenZC-5doc和CbhAdoc共同處理燕麥青干草時(shí),在24h、48h和72h還原糖的產(chǎn)量均高于CenZC-5doc或CbhAdoc單獨(dú)處理燕麥青干草。采用B.subtilis WB700分泌表達(dá)CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc共同降解燕麥青干草2h、48h和72h,還原糖的產(chǎn)量顯著的高于CenZC-5doc和CbhAdoc共同降解燕麥青干草的還原糖產(chǎn)量。CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc共同降解24h、48h和72h的還原糖的產(chǎn)量分別是是CenZC-5doc和CbhAdoc雙酶共同降解的1.38倍、1.42倍和1.17倍。純化B.subtilis WB700分泌表達(dá)CenZC-5doc,CbhAdoc,Xyn BYGdoc和ScafCCR,在體外孵育組裝多酶復(fù)合體,多酶復(fù)合體降解燕麥青干草產(chǎn)生的還原糖量在24h、48h和72h均高于CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc的3酶混合物共同降解產(chǎn)生的還原糖量。
【圖文】：

圖 1-1 纖維素多酶復(fù)合體示意圖Fig1-1 Modular architecture of the cellulosomeCellulosome 的優(yōu)勢(shì)不僅在于多酶系的聚集復(fù)，該復(fù)合體還會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)聚合。早 年就通過(guò) TEM 發(fā)現(xiàn)在用非溶性纖維素培養(yǎng)產(chǎn)生的纖維素酶多酶復(fù)合體能夠聚合徑為 60～200nm 的多聚 Cellulosome (Bayer et al. 1998)。在形成多聚 Cellulosome兩個(gè)不同類型的 Cellulosome 能夠形成二聚體。分析 Cellulosome 結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)losome 能夠通過(guò)其 Scaffold 蛋白 I 型 cohesin 與其他 Cellulosome 的 Scaffold 蛋

（Cohesin-Dockerin）相互作用形成的。Cohesin-Dockerin相互作用將纖維素酶分子結(jié)合到Scaffold上，并且可以通過(guò)不同Scaffold的Cohesin-Dockerin相互作用，連接組裝成更加復(fù)雜的Cellulosome（圖1-2）。Cellulosome可以通過(guò)Cohesin-Dockerin特定相互作用將Cellulosome連接到細(xì)胞表面（圖1-3），從而將多個(gè)酶分子組裝成復(fù)合體(Tokatlidis et al. 1991; Tokatlidis et al. 1993; Salamitou et al. 1992)。人們很早以前對(duì)熱纖梭菌中纖維素酶多酶復(fù)合體進(jìn)行生化分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在一種異常強(qiáng)烈的蛋白相互作用(Fierobe et al. 1999)。后續(xù)分析證實(shí)粘附蛋白與錨定蛋白的相互作用的確是高親和性的相互作用，據(jù)估計(jì)，解離常數(shù)(KD)約為10-9-10-12mol/L，或者更低(Fierobe et al.2001; Mechalyet al. 2001; Yaron et al. 1995; Lytle et al. 2000)。圖1-2 多聚Cellulosome示意圖Fig1-2 Heterodimeric CellulosomeCellulosome中Scaffold的粘附蛋白（Cohesin）通常成串排列，在Cellulosome的組裝中發(fā)揮重要作用。Scaffold的Cohesin數(shù)量在1-11個(gè)之間，，通常情況下都大于4個(gè)(Doi et al.2004)。來(lái)源于C. thermocellum的Cellulosome，Scaffold包含九個(gè)相似的Cohesin
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S816

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王海軍;王艷芳;江鶯;趙文杰;任艷;馬吉?jiǎng)?;人bFGF卵清蛋白分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及分析[J];黑龍江醫(yī)藥;2010年03期

2 龍建銀,王會(huì)信,劉莉;人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在大腸桿菌中的分泌表達(dá)研究[J];生物技術(shù)通訊;1997年Z1期

3 吳宗華;胡波;李朝霞;祝中一;;利用大腸埃希菌分泌表達(dá)乙型肝炎病毒核心抗原[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2011年07期

4 夏雨;成玉梁;李達(dá)倩;呂源玲;;枯草芽孢桿菌分泌載體構(gòu)建及其對(duì)脂肪酶A的分泌表達(dá)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年30期

5 朱向東;徐波;;乳酸菌蛋白質(zhì)分泌表達(dá)研究進(jìn)展[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2008年01期

6 趙穎怡,梁世中,黃鯤,黃日波;一種新型釀酒酵母附加型分泌表達(dá)載體的構(gòu)建[J];微生物學(xué)報(bào);2002年04期

7 張歡歡;陳昶旭;劉中美;周哲敏;;雅致放射毛霉羧肽酶Y在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)[J];食品與發(fā)酵工業(yè);年期

8 孫明軍,趙晨,沙金,韓海棠,鄭克儉,李贊東;雞輸卵管組織特異性分泌表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2003年01期

9 龍建銀,王會(huì)信,劉莉,王芳,周廷沖;人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在大腸桿菌中的分泌表達(dá)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);1999年02期

10 李曉棟;趙香君;霍聞鈞;黃湘;喬亞峰;;pSecTag2A-HBV-L真核分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];醫(yī)學(xué)信息(上旬刊);2010年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 郭虹;史江;盛民立;;重組人TPO生物學(xué)效應(yīng)研究[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第七次會(huì)議論文摘要匯編[C];1999年

2 陸信曜;劉松;張東旭;堵國(guó)成;陳堅(jiān);;細(xì)菌脂肪氧合酶在大腸桿菌中的分泌表達(dá)[A];第八屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

3 趙秋偉;余志良;周政;蔡瑞;袁中一;;不同表達(dá)元件對(duì)青霉素G酰化酶在枯草芽孢桿菌中分泌表達(dá)的影響[A];第四屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)交流討論會(huì)論文集[C];2003年

4 代曉華;朱惠芳;熊冬生;周圓;;人Survivin蛋白克隆、原核分泌表達(dá)與純化[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第三十二屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

5 林洪羽;能昌愛(ài);徐建;王利月;仲飛;李秀錦;;人類CD14信號(hào)肽介導(dǎo)卵清蛋白基因在真核細(xì)胞的高效分泌表達(dá)[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第七屆全國(guó)代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2014年

6 孔寧;周余來(lái);王毅;宿曉云;王芳;叢中一;蘇曼曼;侯宜;顏煒群;;重組人抑瘤素M的表達(dá)、純化及鑒定[A];2010施慧達(dá)杯第十屆全國(guó)青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會(huì)論文集[C];2010年

7 王富強(qiáng);周興軍;王彥芳;田雪虹;張謙;賀秉坤;;hG-CSF大腸桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)第三次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2001年

8 鄒根;江艷萍;陳玲;劉睿;王成樹(shù);周志華;;里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和優(yōu)化[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)第六屆會(huì)員代表大會(huì)（2014年學(xué)術(shù)年會(huì)）暨貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇會(huì)議摘要[C];2014年

9 金俊琰;周莉;趙久剛;桂建芳;;石斑魚(yú)防御素BD2基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及純化[A];湖北省遺傳學(xué)會(huì)、江西省遺傳學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2006年

10 能昌愛(ài);李秀錦;仲飛;李振;張峰;;D14信號(hào)肽序列介導(dǎo)卵清蛋白(OVA)基因在HEK293T細(xì)胞中的分泌表達(dá)[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 程洪遠(yuǎn);墾中“立體化育人”凸顯“立體”[N];海南農(nóng)墾報(bào);2009年

2 記者 曾亮亮;21世紀(jì)是肽治療世紀(jì)[N];經(jīng)濟(jì)參考報(bào);2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張煒煒;纖維素酶系在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)及高效協(xié)同作用的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

2 徐軍;抗凍肽表達(dá)載體構(gòu)建與應(yīng)用、綠色木霉分泌表達(dá)系統(tǒng)及AFP基因內(nèi)含子功能的研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2004年

3 洪斌;鮭魚(yú)降鈣素在鏈霉菌中的分泌表達(dá)[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1996年

4 楊宇;神經(jīng)保護(hù)短肽體內(nèi)分泌表達(dá)策略和治療作用的研究[D];吉林大學(xué);2007年

5 周緒霞;Apidaecin功能基團(tuán)和作用靶位點(diǎn)分析及其在乳酸乳球菌中的分泌表達(dá)[D];浙江大學(xué);2008年

6 聞崇煒;活性多肽的分泌表達(dá)研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2003年

7 田園;豬IFN-γ在畢赤酵母中分泌表達(dá)及大規(guī)模發(fā)酵條件的研究[D];吉林大學(xué);2010年

8 戰(zhàn)榮榮;不同啟動(dòng)子調(diào)控的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)[D];江南大學(xué);2014年

9 關(guān)成冉;枯草芽孢桿菌及鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用研究[D];江南大學(xué);2016年

10 高新星;枯草芽孢桿菌氨肽酶分泌表達(dá)、分子改造及生理功能研究[D];江南大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 婁穎;重組人源甲狀腺過(guò)氧化物酶的分泌表達(dá)及擴(kuò)大培養(yǎng)[D];華東理工大學(xué);2018年

2 高f;EG基因在大腸桿菌中的表達(dá)及BG基因在乳酸菌中的共分泌表達(dá)[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 孫欣;細(xì)胞內(nèi)非分泌表達(dá)淀粉樣蛋白Aβ_（1-42）所致細(xì)胞毒作用的研究[D];吉林大學(xué);2006年

4 劉藝婷;淀粉分支酶在大腸桿菌中的分泌表達(dá)及其分子改造研究[D];江南大學(xué);2017年

5 王延群;牛α干擾素在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)及活性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

6 李英華;鯉魚(yú)生長(zhǎng)激素 cDNA在畢赤酵母中的胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)[D];暨南大學(xué);2001年

7 南志春;性腺激素對(duì)山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞IL-18分泌表達(dá)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

8 李雁飛;多功能淀粉酶OPMA在枯草桿菌中的分泌表達(dá)與性質(zhì)研究[D];吉林大學(xué);2010年

9 何正祥;重組人生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中分泌表達(dá)及其純化的研究[D];安徽大學(xué);2006年

10 朱麗;甜蛋白Brazzein在巴斯德畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

本文編號(hào)：2672650