【摘要】：MLKL是一種假激酶蛋白,最初作為RIPK3的特異性底物被發(fā)現(xiàn),是目前發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡信號(hào)的最下游效應(yīng)分子。由于MLKL的N端四螺旋束功能區(qū)具有與生物膜結(jié)合并介導(dǎo)生物膜打孔或透化的特性,因此MLKL被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡的執(zhí)行者。目前,關(guān)于MLKL生物學(xué)功能的報(bào)道主要集中于細(xì)胞死亡領(lǐng)域,其介導(dǎo)的細(xì)胞壞死性凋亡參與金黃色葡萄球菌的局部和全身性感染以及某些自身炎癥性疾病的發(fā)生。然而,MLKL是否參與調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能并不清楚。沙門菌感染引起的腸炎嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康,是全球重要的公共衛(wèi)生問題。研究調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫反應(yīng)的分子機(jī)制,找到干預(yù)靶標(biāo),有利于沙門菌感染性腸炎的防控。本論文對(duì)MLKL在宿主防御沙門菌黏膜感染中的作用和機(jī)制進(jìn)行了較為深入的研究。利用WT和MLKL~(-/-)小鼠構(gòu)建沙門菌感染性腸炎模型,首先分析MLKL是否影響宿主對(duì)沙門菌的易感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠對(duì)沙門菌黏膜感染更為易感,主要表現(xiàn)為小鼠存活率顯著降低、體重減輕更為明顯,且在沙門菌感染48h后,伴有以盲腸重量減輕、杯狀細(xì)胞減少、黏膜下層水腫明顯、腸上皮完整性破壞明顯、大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及炎性介質(zhì)產(chǎn)生等為主要特征的腸道病理損傷。由于沙門菌經(jīng)消化道進(jìn)入宿主體內(nèi)后,突破腸道黏膜屏障并擴(kuò)散至系統(tǒng)位點(diǎn),引起宿主的胃腸炎、敗血癥及全身性感染(傷寒癥)等。因此,我們推測(cè)沙門菌感染后MLKL~(-/-)小鼠體現(xiàn)的嚴(yán)重腸道炎癥和全身癥狀可能伴隨細(xì)菌的大量定殖,實(shí)驗(yàn)證實(shí)沙門菌感染48h后,MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織和腸系膜淋巴結(jié)(腸道位點(diǎn))與肝臟和脾臟(系統(tǒng)位點(diǎn))均定殖了大量的細(xì)菌�？傊�,沙門菌感染后,MLKL~(-/-)小鼠存活率降低,組織損傷嚴(yán)重,炎性反應(yīng)加劇,沙門菌入侵和擴(kuò)散增多,說明MLKL有助于機(jī)體抗沙門菌黏膜感染。腸道黏膜屏障功能的完整性在防御腸道病原入侵和擴(kuò)散中起重要作用。為了探究MLKL是否通過促進(jìn)黏膜屏障功能完整和維護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)實(shí)現(xiàn)其抗感染作用,我們進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):首先,通過AB-PAS染色和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)盲腸組織中黏蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染48h后,與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織中黏蛋白的表達(dá)顯著減少,且粘液的主要組成成分mucin 2表達(dá)也顯著減少,說明MLKL缺失導(dǎo)致腸道黏膜化學(xué)屏障受損更嚴(yán)重。腸上皮細(xì)胞的更替(增殖和凋亡)也是維護(hù)腸道組織平衡和屏障功能的要素,通過免疫熒光和TUNEL染色發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染48h后,盡管兩種基因型小鼠腸上皮細(xì)胞的增殖無明顯差異,但MLKL~(-/-)小鼠腸上皮細(xì)胞的凋亡明顯增加,說明MLKL信號(hào)參與調(diào)節(jié)組織平衡以維持腸道黏膜層的完整,進(jìn)而限制沙門菌的入侵。此外,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)和免疫蛋白印跡檢測(cè)盲腸組織中緊密連接蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染48h后,盡管兩種基因型小鼠盲腸組織中occludin和ZO-1的表達(dá)無明顯差異,但與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織中claudin-3的表達(dá)顯著減少。與此同時(shí),在體應(yīng)用葡聚糖熒光探針檢測(cè)腸道滲透性的變化情況,發(fā)現(xiàn)在沙門菌感染48h后,與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠腸道的滲透性顯著增加,說明MLKL~(-/-)小鼠的腸道黏膜屏障功能更易被破壞。上述結(jié)果表明,在MLKL基因缺失后,腸道黏膜屏障功能和腸道穩(wěn)態(tài)更易被沙門菌所破壞。然而,上述結(jié)果還不能準(zhǔn)確揭示MLKL的保護(hù)機(jī)制,例如不能明確脆弱的腸道黏膜屏障、過度的炎癥和增多的入侵沙門菌之間的因果關(guān)系,因此進(jìn)行沙門菌急性感染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染6h后,與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠腸道位點(diǎn)的細(xì)菌定殖數(shù)量有明顯的增加趨勢(shì),然而兩種基因型小鼠的腸炎并不顯著,且黏蛋白的表達(dá)也無明顯差異。盡管感染后MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織中claudin-3的表達(dá)減少,但在未感染狀態(tài)下,兩種基因型小鼠盲腸組織中claudin-3的表達(dá)并無明顯差異。這些結(jié)果說明MLKL主要通過限制沙門菌在腸道黏膜的早期定殖,從而阻止腸道黏膜屏障功能和穩(wěn)態(tài)的破壞、抑制過度炎癥和阻止細(xì)菌向系統(tǒng)位點(diǎn)的擴(kuò)散,起到抗沙門菌黏膜感染作用。MLKL如何限制沙門菌的早期定殖,是我們需要探究的新問題。首先,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分析MLKL的表達(dá)定位,發(fā)現(xiàn)在沙門菌感染后,p-MLKL主要表達(dá)于腸隱窩處的上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞。腸上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞均是腸道黏膜天然免疫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),表達(dá)多種模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別病原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng),是構(gòu)成腸道黏膜免疫的第一道防線。然而,通過構(gòu)建WT/MLKL~(-/-)骨髓嵌合體小鼠,發(fā)現(xiàn)主要是腸道黏膜非造血細(xì)胞(腸上皮細(xì)胞)表達(dá)的MLKL限制沙門菌的早期定殖。近年來,炎性體是天然免疫研究領(lǐng)域的前沿課題,相繼發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞表達(dá)的NLRP3、NLRC4和NLRP9b等多種炎性體在防御腸道病原如細(xì)菌、病毒或寄生蟲等感染中發(fā)揮重要作用,因此我們分析MLKL介導(dǎo)的抗感染保護(hù)作用是否依賴于炎性體信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染6h和48h后,與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織中炎性體信號(hào)被顯著抑制。同時(shí),在MLKL基因缺失后,盲腸組織中炎性體活化依賴的IL-18分泌也顯著減少,回補(bǔ)外源的IL-18重組蛋白可顯著降低MLKL~(-/-)小鼠腸道位點(diǎn)和系統(tǒng)位點(diǎn)的沙門菌定殖數(shù)。上述結(jié)果說明腸道黏膜非造血細(xì)胞(腸上皮細(xì)胞)表達(dá)的MLKL通過促進(jìn)炎性體信號(hào)活化,起到限制沙門菌在腸道黏膜早期定殖的作用。綜上所述,本論文證明了壞死性凋亡信號(hào)的效應(yīng)分子MLKL通過促進(jìn)腸道黏膜非造血細(xì)胞(腸上皮細(xì)胞)炎性體信號(hào)活化,限制沙門菌在腸道黏膜的早期定殖,并維護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)和抑制感染性腸炎,從而實(shí)現(xiàn)其抗感染保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1.1 沙門菌突破腸道黏膜屏障的途徑引自 Anna Fa0brega, et al. (2013).門菌穿過腸道黏膜后，其會(huì)被吞噬細(xì)胞所吞噬。目前的研究表

物的入侵以及有害物質(zhì)的吸收；同時(shí)，腸道黏膜屏障可通過選擇性滲透和轉(zhuǎn)運(yùn)，以吸收營養(yǎng)物質(zhì)。腸道黏膜屏障主要由細(xì)胞組分、細(xì)胞間組分以及非細(xì)胞組分（主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌生物活性物質(zhì)）構(gòu)成，以維持其功能的完整性（圖2.1）。圖 2.1 腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)示意圖引自 Mélanie Le Barz, et al. (2015).
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S855.1

【參考文獻(xiàn)】

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3 Simone CS Wolfkamp;Caroline Verseyden;Esther WM Vogels;Sander Meisner;Kirsten Boonstra;Charlotte P Peters;Pieter CF Stokkers;Anje A te Velde;;ATG16L1 and NOD2 polymorphisms enhance phagocytosis in monocytes of Crohn's disease patients[J];World Journal of Gastroenterology;2014年10期

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本文編號(hào)：2672091