【摘要】：近年來(lái),我國(guó)集約化牛場(chǎng)高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡較為普遍,卵巢靜止性乏情率較高,嚴(yán)重影響奶牛繁殖性能,降低了奶牛生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而,目前高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡導(dǎo)致卵巢靜止發(fā)生的蛋白組學(xué)機(jī)制不明,并缺乏相應(yīng)的預(yù)警技術(shù)。因此,本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)開展卵巢靜止奶牛血液蛋白標(biāo)識(shí)物的篩選及關(guān)鍵因子的信號(hào)通路研究,旨在揭示所獲得的蛋白在卵巢靜止發(fā)生中的作用,為建立該病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警體系奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)選取產(chǎn)后14-21天能量正平衡(PEB)和能量負(fù)平衡(NEB)荷斯坦奶牛,跟蹤至其產(chǎn)后60-90天,通過(guò)發(fā)情表現(xiàn)、直腸檢查和B超檢查后,按判定標(biāo)準(zhǔn)將實(shí)驗(yàn)?zāi)膛７譃槁殉察o止組(IO),正常發(fā)情對(duì)照組(CON),每組50頭采集血清。另外,在屠宰場(chǎng)收集來(lái)自同品種、背景相近、無(wú)繁殖疾病、產(chǎn)后健康的經(jīng)產(chǎn)奶牛卵泡顆粒細(xì)胞,根據(jù)卵泡直徑分為三組,大卵泡(L)、中卵泡(M)、小卵泡(S),每組10個(gè)樣品。此外,在IO組和CON組中,每組隨機(jī)選取15頭奶牛血清用于蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn),另外35頭奶牛血清用于ELISA檢測(cè)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如下:1.應(yīng)用iTRAQ/LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)篩選出23種與能量負(fù)平衡相關(guān)的血清差異表達(dá),其中NEB組表達(dá)上調(diào)的有16種,表達(dá)下調(diào)的有7種。根據(jù)生物信息學(xué)結(jié)果提示,這些差異表達(dá)蛋白多與脂類代謝(APOA1、APOA5、APOF、TTR)、蛋白酶復(fù)合體系統(tǒng)(PSMA2、PSMA4、PSMA7 和 PSMB1),及糖酵解(SORD 和 GAPDH)相關(guān);2.經(jīng)產(chǎn)后60-90天奶牛血液生殖激素分析揭示,能量負(fù)平衡能夠引起生殖激素分泌紊亂(FSH和E2的濃度降低),是引起奶牛卵巢靜止的原因之一;3.應(yīng)用iTRAQ/LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)奶牛卵巢靜止血清蛋白組學(xué)的研究,共獲到61種差異表達(dá)蛋白。其中與卵巢靜止相關(guān)的14種差異表達(dá)蛋白。經(jīng)免疫印跡和/或ELISA方法驗(yàn)證的10種差異蛋白中ADIPOQ、IGFBP2和RBP4會(huì)通過(guò)影響生殖激素生物過(guò)程而影響卵泡發(fā)育,GPX3會(huì)通過(guò)氧化應(yīng)激而影響卵泡發(fā)育,且驗(yàn)證結(jié)果與組學(xué)結(jié)果一致;4.為了獲得與卵巢靜止直接相關(guān)的代謝通路及代謝通路的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)選取不同大小卵泡研究糖代謝在卵泡顆粒細(xì)胞中的作用,發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞內(nèi)糖酵解的關(guān)鍵限速酶HK、PEK和差異蛋白ALDOB在從小到大的卵泡中先升高再降低,而關(guān)鍵限速酶PKM2和差異蛋白LDHB 一直降低,提示糖酵解在卵泡發(fā)育早期發(fā)揮作用,且一旦發(fā)生紊亂能夠成為卵巢靜止發(fā)生的主要病因之一;5.為了建立卵巢靜止的預(yù)警體系,實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)后60-90天IO組和CON組奶牛血液中3種能量指標(biāo)、4種生殖激素以及10種關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白,經(jīng)過(guò)相關(guān)性分析、二元邏輯回歸建模以及ROC分析,建立了基于APOA4和ITIH3的單一指標(biāo)的預(yù)警技術(shù),其預(yù)警值分別為APOA428.825 μg/L,ITIH3195.07ng/L;建立了基于APOA4+ITIH3+E2潛在生物標(biāo)志物的多指標(biāo)預(yù)警體系,其預(yù)警值為:APOA447.56μg/L,ITIH4187.80ng/L,E269.63ng/L;6.通過(guò)對(duì)卵巢靜止發(fā)生機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,提示能量負(fù)平衡所致的卵巢靜止與機(jī)體多種代謝異常相關(guān)聯(lián),包括脂類代謝、氧化應(yīng)激、維生素代謝、胰島素及IGF系統(tǒng),以及卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的形成等。說(shuō)明了能量負(fù)平衡所致的奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性。結(jié)論:1)通過(guò)對(duì)能量負(fù)平衡蛋白組學(xué)的分析,提示能量負(fù)平衡與脂類代謝、糖類代謝及蛋白酶復(fù)合體存在密切相關(guān);2)明確了糖酵解過(guò)程在對(duì)卵泡發(fā)育的作用,推測(cè)糖酵解的紊亂時(shí)引起卵巢靜止的主要原因之一;3)建立了卵巢靜止發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警體系,確定了單一指標(biāo)和多指標(biāo)的預(yù)警值;4)構(gòu)建了卵巢靜止發(fā)生的代謝網(wǎng)絡(luò)圖,提示卵巢靜止發(fā)生的多重病因理論,為今后卵巢靜止發(fā)生機(jī)制和防治的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｇｒｏｕｐ，邋ａｎｄ邋ａ邋ｎｅｕｔｒａｌ邋ｂａｌａｎｃｅ邋ｐｏｒｔｉｏｎ邋ｔｏ邋ｍａｉｎｔａｉｎ邋ａｎ邋ｏｖｅｒａｌｌ邋ｍａｓｓ邋ｏｆ邋１４５逡逑ｉＴＲＡＱ試劑結(jié)構(gòu)為同量異位標(biāo)簽，由帶電的報(bào)告基團(tuán)組成，每種試劑中報(bào)告基團(tuán)對(duì)應(yīng)逡逑每一個(gè)樣品。肽反應(yīng)基團(tuán)和中性平衡基團(tuán)以保持總質(zhì)量１４５邋（圖１－３）。這些獨(dú)特的試劑在逡逑ＭＳ／ＭＳ碎裂后產(chǎn)生相應(yīng)的、獨(dú)特的報(bào)告離子（荷質(zhì)比：四標(biāo)：１１４－１１７；六標(biāo)：１１４－１１９：逡逑八標(biāo)：１１４－１２１），用于量化它們各自的樣品。ＭＳ／ＭＳ碎裂除了提供強(qiáng)烈的報(bào)告離子信號(hào)逡逑夕卜，還可以產(chǎn)生ｙ－和ｂ－離子，而不會(huì)改變?nèi)魏翁囟牡碾姾蔂顟B(tài)，從而在定量的同時(shí)可以逡逑更可靠的鑒定蛋白質(zhì)。逡逑肽反應(yīng)基團(tuán)設(shè)計(jì)為能夠與所有伯胺進(jìn)行反應(yīng)，包括賴氨酸側(cè)鏈的Ｎ－端和ｅ－氨基基團(tuán)，逡逑以在多種不同生物樣品中標(biāo)記所有肽，從而增強(qiáng)任何給定蛋白質(zhì)的肽覆蓋，同時(shí)允許保留逡逑其他重要的結(jié)構(gòu)信息，例如翻譯后修飾。逡逑１１逡逑

逡逑圖１－４以４標(biāo)為例的ｉＴＲＡＱ試劑的工作流程，每個(gè)單獨(dú)的樣品被還原、烷基化，并用逡逑胰蛋白酶進(jìn)行酶促消化，然后將得到的肽池分別在一組平行的反應(yīng)中標(biāo)記、合并，然后通逡逑過(guò)液相－質(zhì)譜／質(zhì)譜（Ｌｉｑｕｉｄ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，，邋ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）逡逑聯(lián)用的方法進(jìn)行分析。所獲得的混合物在ＭＳ中產(chǎn)生一組未處理的前體離子，進(jìn)而達(dá)到對(duì)逡逑樣品中低豐度蛋白的增強(qiáng)作用。在ＭＳ中產(chǎn)生的親本片段經(jīng)過(guò)處理后，四個(gè)報(bào)告基團(tuán)離子逡逑在荷質(zhì)比１１４－１１７之間顯現(xiàn)為不同的質(zhì)量。逡逑￣＞？邋ＥＩＭｉ］－ｐＴＣ邋＋逡逑‘各 …口量鎮(zhèn)逡逑——＾邐Ｊ邋－Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－Ｂａｌａｎｃｅ－Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ＩＮＴＡＣＴ邐－邋Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋ＥＱＵＡＬ逡逑－邋４邋ｓａｍｐｔｅｓ邋ｉｄｅｎｔｉｃａｌ邋ｍ／ｚ邐－邋Ｒｅｐｏｒｔｅｒ邋ｉｏｎｓ邋ＤＩＦＦＥＲＥＮＴ逡逑圖１－４四標(biāo)試劑的多重反應(yīng)方案逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｇｅｎｅｒａｌ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋ａ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋（Ｓ１－Ｓ４），逡逑ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｏｕｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｌｏｕｒｓ．逡逑ｉＴＲＡＱ試劑拓展了研究蛋白質(zhì)差異表達(dá)的動(dòng)態(tài)能力，它能提供多種樣本中蛋白的定量逡逑信息，包括時(shí)間過(guò)程分析及疾病標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和闡明。由于樣本中的大多數(shù)肽都適用于該標(biāo)逡逑記策略
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：2670674