沙蔥螢葉甲嗅覺相關(guān)蛋白的鑒定及功能研究

發(fā)布時間：2020-05-17 11:37

【摘要】：沙蔥螢葉甲Galeruca daurica(Joannis)是一種近年來在內(nèi)蒙古草原上暴發(fā)成災的新害蟲,危害沙蔥Allium mongolium、野韭Allium ramosum、多根蔥Allium polyrhizum等百合科Liliaceae蔥屬Alllim植物,嚴重破壞草原生態(tài)環(huán)境。嗅覺感受系統(tǒng)對昆蟲的生命活動起到了至關(guān)重要的作用,昆蟲通過嗅覺來感知外界環(huán)境中的揮發(fā)物質(zhì),從而進行信息交流。目前有關(guān)沙蔥螢葉甲化學感受系統(tǒng)的研究還是空白。本研究從沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組中鑒定到大量的嗅覺相關(guān)基因,并對氣味結(jié)合蛋白和化學感受蛋白基因的表達譜和原核表達嗅覺相關(guān)蛋白與寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特性進行了分析,為進一步研究沙蔥螢葉甲化學感受的分子機理奠定了必要的基礎,并對揭示其猖厥成災機理以及開發(fā)利用引誘劑或驅(qū)避劑控制其發(fā)生危害具有重要的意義。主要研究結(jié)果如下:1.沙蔥螢葉甲觸角感器的顯微觀察利用掃描電子顯微鏡對沙蔥螢葉甲觸角上的感器進行了觀察。結(jié)果表明,沙蔥螢葉甲觸角感器主要有5種類型,分別是毛形感器(sensillatrichodea)、刺形感器(sensilla chaetica)、錐形感器(sensilla basiconica)、鐘形感器(sensilla campaniformia)和 Bohm 氏鬃毛(Bohm bristle)。2.沙蔥螢葉甲嗅覺相關(guān)基因的鑒定及分子特性分析從本實驗室組裝的沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組中鑒定到66條嗅覺相關(guān)基因,包括29條氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因、10條化學感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因、21條嗅覺受體(olfactory receptor,OR)基因(包括1條嗅覺共同受體 olfactory receptor co-receptor,ORco)和6條感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因。序列分析結(jié)果表明,除OBP29外,其它28個OBP基因均具有完整的開放閱讀編碼框(open reading frame,ORF),編碼氨基酸個數(shù)119～202。根據(jù)保守的半胱氨酸殘基數(shù)可將GdauOBP分為Classic OBP和Minus-C OBP兩個亞家族。10條GdauCSP基因均具有完整的ORF,編碼氨基酸個數(shù)98～273,序列中含有四個保守的半胱氨酸。GdauOR基因的ORF均不完整,編碼55～259個氨基酸。6個GdauSNMP中,GdauSNMPla和GdauSNMP1b具有完整的ORF,均含有2個跨膜結(jié)構(gòu)域,序列中含有6個保守的半胱氨酸殘基。其它4個GdauSNMP基因的ORF不完整,序列中只含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域。BlastX驗證的最佳結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析均顯示,沙蔥螢葉甲與大猿葉甲Colaphellus bowringi、榆黃毛螢葉甲Pyrrhalta maculicollis、榆綠毛螢葉甲Pyrrhaltaaenescens等鞘翅目昆蟲嗅覺蛋白的親緣關(guān)系最近。GdauORco在系統(tǒng)進化樹中與鱗翅目、雙翅目、半翅目、直翅目以及鞘翅目其它昆蟲的ORco獨立地形成一支,表現(xiàn)出極度保守的進化機制。3.沙蔥螢葉甲OBP和CSP基因的時空表達格局通過半定量和實時熒光定量技術(shù)對沙蔥螢葉甲OBP和CSP基因的表達譜進行了分析。結(jié)果表明,GdauOBP和GdauCSP基因不僅表達于成蟲觸角中,還廣泛表達于足、翅、頭、胸、腹等各部位。各基因在卵、幼蟲、蛹和成蟲等各發(fā)育階段也有不同程度的表達。超過一半的基因在成蟲觸角中的表達量最高,且雌雄觸角之間的表達水平存在顯著差異。同時,大多數(shù)GdauOBP和GdauCSP基因在卵和蛹中的表達水平相對較低。4.沙蔥螢葉甲OBP和CSP的克隆、原核表達及純化通過 RACE 技術(shù)克隆得到 GdauOBP1、GdauOBBP6、GdauOBP10、GdauOBP20、GdauCSP4和GdauCSP5的cDNA全長序列以及GdauOBP15的ORF序列和3'非編碼區(qū),驗證了 ORF的完整性。成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)/OBP1、pET-28a(+)/OBP6、pET-28a(+)/OBP10、pET-28a(+)/OBP15、pET-28a(+)/OBP20、pET-28a(+)/CSP4和pET-28a(+)/CSP5,通過誘導表達和蛋白純化得到了可溶性重組蛋白。5.沙蔥螢葉甲主要寄主植物揮發(fā)物的鑒定及其觸角電位反應采用頂空動態(tài)收集法和GC-MS技術(shù)從沙蔥螢葉甲最適寄主植物—沙蔥中鑒定出32種揮發(fā)性化合物,并從中選取了 13種主要化合物進行EAG測定。EAG測試結(jié)果表明,二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫、二烯丙基三硫醚、順-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯和己醛7種化合物能引起沙蔥螢葉甲觸角較為強烈的電位反應。此外,雌性對多數(shù)化合物的反應值均高于雄性;當化合物濃度在0.1 mol/L和1 mol/L時,沙蔥螢葉甲的觸角電位反應較高。6.沙蔥螢葉甲OBP和CSP與主要寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特性熒光競爭結(jié)合試驗以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)為探針。結(jié)果表明,GdauOBP1和GdauOBP1O對所有供試的13種寄主植物揮發(fā)物結(jié)合能力均較弱(Ki30μM);GdauOBP6與二甲基二硫醚、己醛、2-己烯醛和順-2-己烯-1-醇有較強的結(jié)合能力,Ki值為 25.65～29.09μM;GdauOBP15特異性地結(jié)合二甲基二硫醚,K值為23.09μM;GdauOBP20僅與對二甲苯和環(huán)庚三烯有較強的結(jié)合能力,Ki值分別為22.91 μM和26.55 μM。兩個CSP對寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合能力差異很大,GdauCSP4對所測化合物具有廣譜的結(jié)合能力,能與其中9種配體較好地結(jié)合,K值為12.06 μM～21.32 μM,其中結(jié)合能力最強的配體是苯甲酸甲酯,其次為己醛;而GdauCSP5的結(jié)合譜較窄,僅能較好地結(jié)合二甲基二硫醚和2-己烯醛,Ki值分別為26.47μM和25.28 μM。所有7個重組蛋白與二烯丙基硫醚、月桂烯和二烯丙基三硫醚的結(jié)合能力均較弱(Ki30 μM)。
【圖文】：