【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種高致病力、高死亡率的接觸性傳染病。該病在我國一直流行,且以地區(qū)散發(fā)性為主;盡管各大養(yǎng)殖場對CSF給予極大的關注,但由于不科學的免疫程序、參差不齊的疫苗質(zhì)量及豬群不規(guī)范的飼養(yǎng)條件等,致使當前CSF仍然嚴重威脅著我國的養(yǎng)豬業(yè)。E0、E1及E2是CSFV的三個囊膜糖蛋白,其中E2是病毒最主要的抗原蛋白,同時E2也在CSFV與宿主細胞的相互識別及吸附過程中起重要介導作用;因此,E2蛋白的深入研究,對于探討CSF的感染機制及新型疫苗的設計都具有重要意義。計算機輔助多肽設計技術的飛速發(fā)展,尤其是虛擬分子對接技術的廣泛應用,為多肽篩選提供了高效的技術途徑,也使得配體與受體之間相互作用的研究更加深入�；诜肿訉蛹夹g的多肽虛擬篩選,不僅操作簡單快捷、降低多肽篩選的強度及縮短研發(fā)周期,還大大地提升了篩選成功率。本研究借助虛擬分子對接技術,設計多條靶向CSFVE2蛋白的親和肽,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及等離子體共振試驗(SPR)鑒定其親和性,之后通過體外抑制試驗評價其抗CSFV感染的活性,為深入研究E2在病毒感染中的作用提供新思路;并通過多肽與磁珠偶聯(lián),初步建立快速純化水稻表達E2蛋白的方法,為新型高效疫苗的研發(fā)提供可靠的技術支持。1豬瘟病毒E2蛋白親和肽的理性設計隨著越來越多蛋白質(zhì)晶體結構被解析,基于結構模型的計算機輔助多肽設計技術也呈現(xiàn)快速的發(fā)展。本研究借助分子模擬對接及虛擬篩選技術,組建一系列不同長度的隨機多肽組合庫,將庫中的多肽與同源建模的CSFV E2蛋白上特定的位點實施分子對接,并通過MOLCAD模塊分析復合物的相互作用力,最后利用軟件評分系統(tǒng)對對接結果進行綜合評定與分析,設計出一系列靶向CSFV E2的親和性多肽,以期為后續(xù)的抗CSFV感染、新型疫苗設計等研究提供幫助。2豬瘟病毒E2蛋白親和肽的篩選及鑒定首先,本研究通過ELISA及SPR試驗鑒定人工合成的多肽序列與CSFVE2蛋白相互作用的親和性及特異性;結果顯示57條多肽中有18條與E2存在不同程度的親和性結合,其中P86、P88、P708、P704、P92、P90與E2具有較高親和力,平衡解離常數(shù)(KD)值分別為 1.49nM、3.88nM、4.72nM、4.84nM、49.4nM 及 50.8nM,表明借助分子對接技術設計的靶向E2親和肽是可行的,并為后期試驗研究提供可靠的試驗數(shù)據(jù)及材料。其次,將兩種不同策略GalaxyPepDock及FlexX/SYBYL給出的多肽序列評分值與其KD值的相關性進行分析,以期驗證全局搜索及局部搜索策略在蛋白與多肽配基對接中的重要性;結果顯示,FlexX/SYBYL預測的Cscore值與多肽KD值之間的Kendall和Spearman相關系數(shù)分別為-0.637及-0.767,呈中等程度的相關性,表明實施分子對接時采用局部搜索且充分考慮多肽的柔性要優(yōu)于全局搜索的對接策略。本試驗數(shù)據(jù)為今后多肽配基的分子設計提供合理的參考,也為蛋白質(zhì)功能解析提供有效的指導。3豬瘟病毒E2蛋白親和肽的抗病毒活性研究阻止病毒侵染宿主細胞是研究抗病毒感染的重要方式之一。本研究在前一章篩選到6條靶向CSFV E2高親和肽的基礎上,通過體外抑制試驗進一步評價其抗CSFV感染的活性;病毒與多肽孵育后接種PK-15細胞,結果顯示6條多肽在一定程度上均能抑制CSFV感染,其中P88、P86及P708的抑制率高達80%以上,抑制活性最好;同時,多肽封閉細胞后接種病毒,結果顯示6條多肽抗CSFV感染的活性較差,表明靶向E2的親和肽不能通過封閉受體而阻止CSFV入胞,進一步證實親和肽的抗病毒靶點在病毒表面而不是細胞膜上。本試驗結果可為進一步研究病毒受體及抗病毒藥物設計提供線索及理論依據(jù)。4親和肽在豬瘟新型疫苗前期研究中的應用作為CSFV的免疫優(yōu)勢蛋白,E2 一直是CSFV新型亞單位疫苗研制的重點。本研究在前期借助分子對接技術篩選到靶向E2親和肽的基礎上,將其固定在磁珠上,成功從粗提水稻蛋白中純化到有效的E2蛋白,初步建立了快速純化水稻表達E2蛋白的方法;小鼠免疫抗體評價顯示,免疫劑量為l0μg和25μg的純化E2蛋白組,在接種后第14天抗體就達到陽性水平,且隨接種時間推移,呈逐漸增長的趨勢,到接種后第42天抗體阻斷率可高達86.18%和90.68%,刺激機體產(chǎn)生的免疫保護反應遠遠優(yōu)于對照組,表明靶向E2的親和肽純化水稻表達E2蛋白是高效、可靠的。這種新的多肽設計方法為新型疫苗的設計及研發(fā)提供有力的技術支持也為蛋白多肽配基的篩選提供更為廣闊的平臺。
【圖文】：

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注：紅色圓圈所標示為兩個單體中ＣＳＦＶＥ２的主要抗原區(qū)域所在位置逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｍｏｎｏｍｅｒｓ邋ｏｆ邋３Ｄ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＣＳＦＶ邋Ｅ２邋ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｉｎ邋ｃｈａｉｎ邋Ａ邋ａｎｄ邋ｃｈａｉｎ邋Ｂ邋（ｅｎｃｌｏｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｒｅｄ邋ｃｉｒｃｌｅ）．逡逑１５逡逑
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651

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本文編號：2668225