【摘要】：本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),uPA與錨定于自身細胞膜外的uPAR結合,進而促進細胞的增殖。為了深入了解uPA與uPAR調節(jié)體外培養(yǎng)牛卵丘顆粒細胞增殖的具體機制,本研究綜合細胞培養(yǎng)、細胞增殖、Western bot、ELISA等多種技術,探討了uPA、uPAR、cAMP和磷酸化ERK與AKT表達在牛卵丘顆粒細胞增殖過程中可能的互作機制。研究結果顯示,(1)0.5ng/mL uPA分別作用不同時間2、5、10、20、30min后,5 min處理組顯示最高的ERK與AKT磷酸化水平,均極顯著高于對照組(P0.01);聯(lián)合添加0.5 ng/mL uPA與1μg/mL Amiloride處理5 min后,與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+Amiloride)中磷酸化ERK與AKT表達量極顯著降低(P0.01),說明Amiloride能夠明顯抑制uPA對牛卵丘顆粒細胞中磷酸化ERK與AKT表達的促進作用。(2)聯(lián)合添加0.5 ng/mL uPA與10μL/mLuPAR抗體繼續(xù)培養(yǎng)5 min后,與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+uPAR抗體)的磷酸化ERK與AKT極顯著降低(P0.01),說明uPA與其受體uPAR結合后,能夠激活ERK與AKT信號。(3)聯(lián)合添加uPA與Amiloride或者uPA與uPAR抗體分別培養(yǎng)5 min后,與對照組比較,添加uPA組能顯著上調cAMP水平(P0.01);與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+Amiloride或uPA+uPAR抗體)極顯著下調了cAMP水平(P0.01),說明Amiloride能夠抵消uPA對卵丘顆粒細胞內cAMP水平的提升作用,而此過程與uPAR相關。(4)聯(lián)合添加0.5μM Rp-cAMP與uPA培養(yǎng)5 min后,與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+Rp-cAMP)的磷酸化ERK與AKT表達量極顯著降低(P0.01),說明uPA通過上調cAMP水平,刺激PKA信號通路,進而激活下游ERK與AKT磷酸化過程。(5)聯(lián)合添加Rp-cAMP與uPA培養(yǎng)48 h后,與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+Rp-cAMP)中卵丘顆粒細胞數(shù)量極顯著降低(P0.01),說明Rp-cAMP能夠抵消uPA對卵丘顆粒細胞增殖的誘導作用。綜上所述,本研究揭示了uPA與uPAR調節(jié)牛卵丘顆粒細胞增殖的信號機制:uPA結合卵丘顆粒細胞膜上受體uPAR,上調細胞內cAMP水平,激活PKA通路,使下游ERK與AKT被磷酸化,最終促進體外培養(yǎng)的牛卵丘顆粒細胞增殖。本研究結果對于深入理解牛卵泡發(fā)育調控機制,具有重要意義。
【圖文】：

果與分析的培養(yǎng)及生長狀態(tài)接接種貼壁的方法進行培養(yǎng)牛卵丘顆粒細胞。原代培養(yǎng)牛卵丘顆 1×105個/mL 進行接種到 25 cm2培養(yǎng)瓶中，，12-24 h 后觀察到細胞形變成長梭形，向兩頭伸展成長梭形；2-3 d 后，細胞逐漸呈長條開始匯合。4 d 后卵丘顆粒細胞大量貼壁生長，部分細胞變成多長滿瓶底，基本匯合成單層，細胞基本呈現(xiàn)不規(guī)則的多邊形，之細胞培養(yǎng)過程中匯合達到 80%左右，即可進行傳代培養(yǎng)。傳代培血清的 DMED 中生長旺盛，6 h 即可見到細胞貼壁。在早期(1現(xiàn)出長梭形，偶爾也會出現(xiàn)多邊形(見圖 1)。

圖 2 添加 uPA 處理不同時間后對培養(yǎng)牛卵丘顆粒細胞中 ERK1/2 磷酸化表達的影響ERK1/2 和 p-ERK1/2 熒光條帶(A)，p-ERK/ERK 熒光分析值（B）�！�**”代表差異極顯著（P<0.01）。Fig.2 Effect of uPA with different treating periods of 0, 2, 5 10,20 and30 mins on ERK1/2 phosphorylatioof bovine cumulus granulosa cells cultured. Immunoreactive bands corresponding to active ERK1/2 andp-ERK1/2is indicated as A , p-ERK/ERK value as B.“**”presents the significant difference (P<0.01).
【學位授予單位】：內蒙古農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S823

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 龔曉萌;王黎明;姜漢國;;PI3K/AKT信號傳導通路對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2010年06期

2 金艷梅;;顆粒細胞對卵泡發(fā)育的影響[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年08期

相關博士學位論文 前1條

1 龍旭;基于PI3K/AKT信號通路研究新加歸腎丸調節(jié)大鼠卵巢顆粒細胞增殖、凋亡的分子機制[D];成都中醫(yī)藥大學;2015年

相關碩士學位論文 前1條

1 劉倩;TCDCA對TGR5介導的信號通路中cAMP含量的影響[D];內蒙古農業(yè)大學;2014年

本文編號：2667952