【摘要】：心包積液綜合征(HPS)是由禽腺病毒引起的高度傳染性疾病,于1987年首次在巴基斯坦的安加拉地區(qū)爆發(fā),因此又被稱作“安加拉病”。禽腺病毒為無(wú)囊膜病毒,基因組為雙鏈DNA,病毒的核衣殼由六鄰體(hexon)、五鄰體(penton)和纖絲蛋白(fiber)組成。penton蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白,參與病毒侵入細(xì)胞和病毒粒子組裝的過(guò)程�？筽enton蛋白的抗體具有顯著的病毒中和作用,由penton蛋白制備的亞單位疫苗能為動(dòng)物提供90%的保護(hù)率。病毒fiber蛋白通過(guò)其N末端與penton蛋白結(jié)合,其頭端在病毒感染過(guò)程中可以與細(xì)胞表面的受體結(jié)合,在病毒感染過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用,通過(guò)真核和原核表達(dá)系統(tǒng)制備的fiber2亞單位疫苗對(duì)SPF雞具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力。近年來(lái)禽腺病毒在我國(guó)雞群的感染普遍,給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,目前尚無(wú)商品化的疫苗。為了研制用于該病預(yù)防的活疫苗,本研究在病原流行病學(xué)研究基礎(chǔ)上,以新城疫病毒(NDV)為載體表達(dá)了該病毒的五鄰體和纖絲蛋白,并對(duì)重組病毒的免疫效力進(jìn)行了測(cè)定,旨在為該病的防控提供有力工具。1.I群禽腺病毒的分離鑒定與遺傳進(jìn)化分析通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化,建立了 LMH細(xì)胞培養(yǎng)禽腺病毒的方法,經(jīng)LMH細(xì)胞擴(kuò)增的禽腺病毒滴度可達(dá)到108.5TCID50/ml,而通過(guò)傳統(tǒng)絨毛尿囊膜擴(kuò)增的禽腺病毒滴度為106.5TCID50/ml,表明通過(guò)LMH細(xì)胞培養(yǎng)可以收獲更高滴度的禽腺病毒,培養(yǎng)滴度較傳統(tǒng)方法提高了 100倍。2015-2017年共收到送檢疑似禽腺病毒感染樣品27份,通過(guò)PCR鑒定后,分離得到了 18株Ⅰ群禽腺病毒,其中有16株屬于血清4型,有2株屬于血清1型,表明在我國(guó)心包積液綜合征主要由血清4型禽腺病毒感染所引發(fā)。分別對(duì)16株血清4型禽腺病毒病毒的hexon、penton和fiber2基因序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)16株病毒的這三個(gè)基因與國(guó)內(nèi)參考株之間的同源性均為100%,與國(guó)外分離株相比具有不同程度的遺傳差異,其中與印度分離株最近。氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)hexon的195位氨基酸殘基是Q,而國(guó)外毒株的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)是E;國(guó)內(nèi)分離毒株penton的426位和486位分別是V和T,而國(guó)外毒株對(duì)應(yīng)位點(diǎn)分別是I和S,表明我國(guó)流行的禽腺病毒具有特征性的遺傳標(biāo)記,通過(guò)這些特征性的氨基酸序列可以將國(guó)內(nèi)外的禽腺病毒分離毒株進(jìn)行有效區(qū)分。此外,挑選了不同年份的血清4型禽腺病毒3株,經(jīng)肌肉接種SPF雞后,可導(dǎo)致100%發(fā)病,剖檢可見(jiàn)明顯的心包積液病變,表明該疾病復(fù)制成功。2.分別表達(dá)禽腺病毒penton和fiber2蛋白的重組新城疫病毒構(gòu)建及其免疫效力選取具有良好復(fù)制能力和免疫原性的基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)致弱毒株AI4作為骨架,分別將血清4型分離株JSYC2017株的penton和fiber2基因插入到AI4的P和M基因之間,構(gòu)建得到重組NDV全長(zhǎng)質(zhì)粒:pNDV/rAI4-penton和pNDV/rAI4-fiber2。將全長(zhǎng)質(zhì)粒和NDV三個(gè)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞后成功拯救出重組NDV病毒,分別命名為:rAI4-penton 和 rAI4-fiber2。重組病毒的雞胚最小致死劑量平均死亡時(shí)間(MDT)大于120h,呈典型的弱毒特性,且在雞胚中具有良好的復(fù)制能力,rAI4-penton和rAI4-fiber2在雞胚尿囊液的HA效價(jià)分別為9log2和7log2,EID50分別為1.5×108/ml和3.2×107/ml,病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明重組病毒與載體病毒具有相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性。重組病毒在雞胚中連續(xù)傳5代后仍能表達(dá)外源蛋白,顯示出了較好的遺傳穩(wěn)定性。將重組病毒rAI4-penton和rAI4-fiber2以106EID50/只的劑量滴鼻點(diǎn)眼免疫SPF雞,免疫后3周,重組病毒rAI4-penton免疫組可以檢測(cè)到針對(duì)禽腺病毒的中和抗體,中和效價(jià)為1:64,攻毒后重組病毒rAI4-penton對(duì)免疫雞能提供有效的保護(hù)效力。上述研究為禽腺病毒重組活載體疫苗的研制提供了有益參考。
【圖文】：

３結(jié)果逡逑３．１邋ＬＭＨ細(xì)胞的培養(yǎng)與病毒傳代逡逑在本實(shí)驗(yàn)室利用ＬＭＨ細(xì)胞成功培養(yǎng)了血清４型禽腺病毒，由圖１－１可知，未接種病逡逑毒前，ＬＭＨ細(xì)胞呈現(xiàn)多形性，有樹(shù)突樣結(jié)構(gòu)，接種后，細(xì)胞易感、發(fā)生明顯病變，出現(xiàn)皺逡逑縮變圓。按照２．７中的方法對(duì)擴(kuò)增的禽腺病毒的ＴＣｒｏ５0進(jìn)行滴定，滴度達(dá)到１０８邋５ＴＣＩＤ５0／ｍｌ，逡逑表明禽腺病毒在ＬＭＨ細(xì)胞中成功擴(kuò)增并達(dá)到較高滴度，將擴(kuò)增的病毒置于－７０°Ｃ保存以備逡逑后用。逡逑

３．７動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)逡逑在不同年份的分離株中挑選３株，分別用絨毛尿囊膜接種和ＬＭＨ接種進(jìn)行培養(yǎng)，通逡逑過(guò)測(cè)量病毒的ＴＣＩＤ５0，，三株病毒在尿囊膜或ＬＭＨ細(xì)胞上擴(kuò)增的滴度相當(dāng)（圖１－４），采用逡逑尿囊膜擴(kuò)增的病毒滴度達(dá)到１０＆５ＴＣＩＤ５（）／ｍｌ，而通過(guò)ＬＭＨ細(xì)胞擴(kuò)增后，滴度達(dá)到逡逑１０８邋５ＴＣＩＤ５Ｑ／ｍｌ，病毒滴度是傳統(tǒng)的雞胚擴(kuò)增方法的１００倍。逡逑３邋ｉ0ｉ邋Ｉ邋＊＊邋Ｉ邋？邋＊＊邋｜邋Ｉ邋＊＊邋Ｉ逡逑ｇ邐１邐＇邐１邐１邐１邐１邋Ｍ邋Ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ邋ｃｈｉｃｈｅｎ邋ｅｇｇｓ逡逑８．邋品邐；ｉＴｉ邐＿邋ｌｍｈ逡逑§邐磁邐ｆｉｆ邐ｆ》：逡逑�。唬保湾义希迹姡掊澹阱义希澹澹义蠄D１４分離株在雞胚和ＬＭＨ細(xì)胞上的繁殖滴度逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｔｈｅ邋ｔｉｔｅｒｓ邋ｏｆ邋ＦＡＶ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ＥＣＥ邋ａｎｄ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ逡逑將擴(kuò)增的病毒接種ＳＰＦ雞后，３ｄ起開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)被毛雜亂，精神萎靡，食欲減退，逡逑可見(jiàn)臥地不起和死亡，發(fā)病率為１００％，剖檢可見(jiàn)肝臟黃染質(zhì)脆，心包內(nèi)有透亮的積液（見(jiàn)逡逑？Ｉ！邋＾逡逑圖１－５血清４型禽腺病毒分離株對(duì)雞的感染性實(shí)驗(yàn)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ｃｈｉｃｋｅｎｓ邋ｗｉｔｈ邋ｓｅｌｅｃｔｅｄ邋ＦＡＶ４邋ｉｓｏｌａｔｅｓ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2666092