發(fā)布時(shí)間：2020-05-14 21:52

【摘要】：乳酸桿菌為應(yīng)用最早、研究最多的益生菌種之一,廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖。但是,目前研究集中于菌種篩選和應(yīng)用效果評(píng)價(jià),而乳酸桿菌特別是其成分和培養(yǎng)上清對(duì)動(dòng)物腸道的實(shí)際免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)未引起足夠關(guān)注。本研究旨在解析鼠李糖乳酸桿菌(LGG)和羅伊氏乳酸桿菌(ZJ617)組成成分與代謝產(chǎn)物(培養(yǎng)上清)對(duì)脂多糖(LPS)致敏小鼠腸道免疫和屏障功能、肝臟炎癥的緩解調(diào)節(jié)作用,解析乳酸桿菌益生調(diào)節(jié)機(jī)制。1)體外細(xì)胞試驗(yàn)研究:構(gòu)建LPS致敏的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(RAW264.7)炎癥模型,分析LGG不同成分(SLP、CpG和DNA)和及其代謝產(chǎn)物預(yù)處理對(duì)細(xì)胞的免疫調(diào)控作用。結(jié)果顯示:與對(duì)照組組比較,SLP與CpG或DNA組合可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化,優(yōu)于SLP、CpG和DAN單獨(dú)使用的效果。乳酸桿菌無細(xì)胞上清液(LGGs和ZJ617s)預(yù)處理細(xì)胞,顯著抑制LPS誘導(dǎo)的LC3表達(dá)、ERK1/2和mTOR的磷酸化升高,同時(shí)提高抑制信號(hào)分子I-κBα表達(dá),發(fā)揮抑制緩解炎癥作用。2)動(dòng)物試驗(yàn)研究(腸道):以連續(xù)灌胃乳酸桿菌無細(xì)胞上清液LGGs和ZJ617s兩周后(劑量為0.2ml/天,劑量相當(dāng)于用10~9的LGG和ZJ617菌體處理),腹腔注射LPS,致敏24小時(shí)后,屠宰采集血清、肝臟和腸道樣品。采用免疫印跡Western blot、免疫熒光、ELISA、代謝組學(xué)方法,分析乳酸桿菌培養(yǎng)上清液對(duì)回腸的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)和對(duì)肝臟的保護(hù)作用。1)腸道組織結(jié)果顯示:LPS刺激后,小鼠回腸通透性增加,絨毛高度降低,TLR4、LC3、Atg5、Caspase-3和SOD2表達(dá)量均顯著上調(diào);LGGs和ZJ617s干預(yù)后,腸道屏障功能恢復(fù)到正常水平,蛋白的表達(dá)與對(duì)照組無顯著差異。2)回腸內(nèi)容物代謝組學(xué)分析顯示,Con組與LPS組之間總共有35個(gè)差異代謝物(33個(gè)上調(diào),2個(gè)下調(diào));LPS組與LPS+ZJ617s組相比,共有16個(gè)差異代謝物,均顯著降低;三組之間比較共有10個(gè)差異代謝物。3)動(dòng)物試驗(yàn)研究(肝臟):腸道屏障功能和穩(wěn)恒,進(jìn)一步會(huì)影響肝臟功能,存在肝腸軸,為此,動(dòng)物試驗(yàn)同上,進(jìn)一步分析乳酸桿菌上清液LGGs和ZJ617s對(duì)LPS刺激小鼠肝臟功能的影響。小鼠肝組組織病理切片顯示,ZJ617s和LGGs組明顯改善LPS致敏小鼠肝炎中的肝小葉結(jié)構(gòu)。LPS刺激后小鼠血清D-木糖和二胺氧化酶(DAO)水平顯著升高,而ZJ617s和LGGs處理恢復(fù)其值正常水平。LPS刺激導(dǎo)致Claudin3、Occludin和ZO1蛋白表達(dá)下調(diào),ZJ617s預(yù)處理后回歸正常水平。炎癥信號(hào)通路分析顯示,LPS刺激導(dǎo)致肝臟TLR4顯著增加,ZJ617s和LGGs處理使其蛋白表達(dá)回歸正常水平;LPS刺激顯著提高了p38、ERK和JNK的磷酸化水平,而ZJ617s和LGGs預(yù)處理組磷酸化水平恢復(fù)至正常水平。自噬信號(hào)通路分析顯示,LPS刺激引起肝臟自噬信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Atg5和LC3顯著升高,引發(fā)過度自噬,而ZJ617s和LGGs預(yù)處理顯著降低LPS的刺激誘發(fā)的過渡自噬。凋亡信號(hào)通路分析顯示,LPS刺激顯著增加小鼠肝臟凋亡通路上的SOD2和Caspase3蛋白的表達(dá)量,ZJ617s和LGGs的處理使其蛋白表達(dá)回歸到正常水平。因此,乳酸桿菌LGG的有效成分SLP+CpG和SLP+DNA能顯著緩解LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。LGGs和ZJ617s干預(yù),使LPS刺激小鼠腸道屏障功能恢復(fù)到正常水平。乳酸桿菌上清液通過抑制TLR4-MAPK-NF-κB炎癥信號(hào)通路、自噬和凋亡信號(hào)通過,緩解LPS誘導(dǎo)肝臟損傷。
【圖文】：

圖2.1不同時(shí)間點(diǎn)的LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響Fig2.1 Western blot analysis of MAPK and NF-κB activation in RAW264.7 cells stimulatedby LPS at different time points.Values are means ± SD, n=3. Different letters indicate thechange between eac h group is statistically significant (P < 0.05).2.2 LGG 對(duì) LPS 致敏的 RAW264.7 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用構(gòu)建 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系模型，選取 MOI=10 的 LGG 預(yù)處理細(xì)胞 2 h，再用 200 ng/mL 脂多糖 LPS 刺激 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 0.5 h，檢測 I-κB 表達(dá)量、ERK1/2 和其磷酸化水平、p38 和其磷酸化水平。結(jié)果顯示，LPS 組的 p38 和 ERK1/2 磷酸化水平明顯升高，I-κB 蛋白表達(dá)量顯著降低。LGG預(yù)處理 2 h 后 p38 和 ERK1/2 的磷酸化水平顯著下降，I-κB 蛋白表達(dá)量顯著升高。

圖2.1不同時(shí)間點(diǎn)的LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響Fig2.1 Western blot analysis of MAPK and NF-κB activation in RAW264.7 cells stimulatedby LPS at different time points.Values are means ± SD, n=3. Different letters indicate thechange between eac h group is statistically significant (P < 0.05).2.2 LGG 對(duì) LPS 致敏的 RAW264.7 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用構(gòu)建 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系模型，，選取 MOI=10 的 LGG 預(yù)處理細(xì)胞 2 h，再用 200 ng/mL 脂多糖 LPS 刺激 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 0.5 h，檢測 I-κB 表達(dá)量、ERK1/2 和其磷酸化水平、p38 和其磷酸化水平。結(jié)果顯示，LPS 組的 p38 和 ERK1/2 磷酸化水平明顯升高，I-κB 蛋白表達(dá)量顯著降低。LGG預(yù)處理 2 h 后 p38 和 ERK1/2 的磷酸化水平顯著下降，I-κB 蛋白表達(dá)量顯著升高。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.2

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本文編號(hào)：2663990