【摘要】：雞馬立克氏病(Marek's disease,MD)是由馬立克氏病病毒(MDV)引起的一種雞的惡性淋巴增生性腫瘤疾病,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。MDV有3個(gè)血清型,其中1型為致瘤型,主要破壞T細(xì)胞,可引起免疫抑制。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)MDV的致瘤機(jī)制做了大量的研究,但具體的機(jī)制還不是很清楚。外泌體是一類直徑介于30nm-150nm之間的由細(xì)胞分泌的細(xì)胞外小囊泡,可攜帶蛋白、microRNA(miRNA)等成分,在細(xì)胞間物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞中起重要作用。miRNA是一種長(zhǎng)度僅有19-25nt左右的非編碼小RNA,其本身的生產(chǎn)加工成熟機(jī)制及功能已獲得巨大的研究成果。特別是在人類癌癥疾病中,miRNA在癌癥疾病中不僅可以作為癌基因,也可作為腫瘤抑制因子,還可作為癌癥標(biāo)志物。其靶向腫瘤抑制因子時(shí),當(dāng)其上調(diào)可抑制靶向的抑癌基因,促進(jìn)癌癥的發(fā)展。近幾年研究也發(fā)現(xiàn),外泌體可通過直接或間接的作用影響腫瘤的發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的遷移。PTEN是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的抑癌基因,是P13K/Akt/mTOR信號(hào)通路中的一種負(fù)調(diào)節(jié)因子,多年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),PTEN影響腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、生長(zhǎng)、遷移及凋亡。PTEN在人類疾病的研究中十分常見,但是對(duì)于禽類癌癥的研究卻極其稀少。那么MD作為禽類腫瘤的模型,在MDV感染過程中,外泌體及其組分在MD發(fā)生發(fā)展中起什么作用,靶向PTEN的miRNA有哪些,又是如何作用的呢?本研究以MDV為研究對(duì)象,分別從感染了馬立克強(qiáng)毒株MD5的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和未感染的CEF培養(yǎng)上清中分離純化外泌體,質(zhì)譜(MS)和Western blot分析表明,MDV感染的細(xì)胞外泌體中含有MDV的病毒蛋白VP22,PP38,gB等成分,細(xì)胞增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),外泌體可以刺激雞脾細(xì)胞增殖;高劑量的細(xì)胞外泌體可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞IFN-y分泌;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MDV感染的細(xì)胞外泌體抑制CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞。外泌體高通量測(cè)序結(jié)果表明,MDV感染與未感染病毒細(xì)胞上清外泌體中相比有26個(gè)miRNA上調(diào),257個(gè)miRNA下調(diào),其中預(yù)測(cè)靶向PTEN的miRNA有3個(gè),分別為miR-74、miR-72、miR-43,進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-43可能靶向PTEN。過表達(dá)miR-43后,PTEN的mRNA水平下調(diào),抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,為接下來(lái)確定miR-43與PTEN的靶向關(guān)系奠定了基礎(chǔ),也為MDV的致瘤機(jī)制研究提供了新的方向。
【圖文】：

已知細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體較于血液中的外泌體而言偏少，且不同細(xì)胞分泌的外逡逑泌體，其大小可能會(huì)不同，但是從透射電鏡中觀察其形態(tài)，都會(huì)有類似“茶杯托”的形逡逑狀。圖１－１Ａ電鏡顯示，ＭＤＶ感染和未感染的ＣＥＦ細(xì)胞上清中可觀察到典型的杯狀形逡逑態(tài)的囊泡，大小約３０－１００ｎｍ。感染組的細(xì)胞上清所提取的外泌體接種ＣＥＦ，未產(chǎn)生細(xì)逡逑胞病變，表明所提取的外泌體中不含ＭＤＶ病毒粒子，如圖１－１Ｂ。逡逑３．２邋ＢＣＡ測(cè)定外泌體濃度逡逑本試驗(yàn)運(yùn)用ＢＣＡ邋（碧云天）檢測(cè)試劑盒測(cè)定出所提取的外泌體的濃度，根據(jù)公式計(jì)逡逑算正常ＣＥＦ提取的外泌體濃度約為１．０２ｍｇ／ｍｌ，邋ＭＤＶ感染的ＣＥＦ提取的外泌體濃度為０．９８逡逑ｍｇ／ｍｌ0逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｏｓｏｍｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｍａｒｋｅｒｓ逡逑驗(yàn)采用的是差速離心法提取細(xì)胞上清中的外泌體，為了驗(yàn)證提取的外ｌｏｔ方法檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物Ｈｓｐ７０，邋ＣＤ６３邋ａｎｄ邋ＣＤ９。圖１－２顯示，所能檢測(cè)到外泌體的標(biāo)志蛋白ＨＳＰ７０、ＣＤ９和ＣＤ６１。逡逑感染對(duì)ＣＥＦ細(xì)胞外泌體蛋白組成的影響逡逑一步鑒定來(lái)自不同ＣＥＦ來(lái)源的外泌體蛋白組成，通過質(zhì)譜法分析外泌如圖１－３所示。通過比對(duì)多肽序列與雞和ＭＤＶ蛋白質(zhì)文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)ｍｄ５正常ＣＥＦ外泌體相比有２８９種表達(dá)差異的蛋白，其中，１４７種上調(diào)（ｒａｔｉｏ調(diào)（ｒａｔｉｏ＜０．５）。且ｍｄ５感染的外泌體中包含２０種ＭＤＶ蛋白，包括特，糖蛋白ｇｂ，，被膜蛋白ＶＰ２２等，ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ結(jié)果與ＭＳ—致（圖１－４
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.31

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本文編號(hào)：2654585