【摘要】：沙門(mén)氏菌(Salmonella)是引起食源性疾病的首要因素,被全世界認(rèn)為是首選控制的食源性致病菌之一。人和動(dòng)物感染Salmonella后可引起嚴(yán)重的胃腸炎導(dǎo)致食物中毒,感染嚴(yán)重者還能導(dǎo)致其死亡,是危害人類(lèi)健康的重大隱患,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于Salmonella表型特征并不穩(wěn)定,因此利用表型分型所能獲得的菌株之間的相關(guān)信息并不詳盡,無(wú)法鑒別生化特性、血清型相同的不同Salmonella菌株。為了能夠更好地對(duì)Salmonella進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和溯源,更快地應(yīng)對(duì)食品安全的緊急情況,具有高通量、靈敏度高、重復(fù)性好、便于推廣等優(yōu)點(diǎn)的分子分型技術(shù)將成為必需的技術(shù)。本課題利用兩種基因分型技術(shù)分別對(duì)廣西地區(qū)市售生鮮肉源的Salmonella優(yōu)勢(shì)血清型分離株進(jìn)行基因分型,目的是尋找一種能夠?qū)κ称肺廴镜腟almonella進(jìn)行快速溯源的分子技術(shù)。同時(shí)對(duì)近年來(lái)廣西生鮮肉源Salmonella的喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥現(xiàn)狀進(jìn)行研究。本課題選取實(shí)驗(yàn)室保存的2011-2016年從廣西部分地區(qū)超市及自由市場(chǎng)售賣(mài)的生鮮雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉中分離的Salmonella兩個(gè)優(yōu)勢(shì)血清型S.derby和S.agona之71株和21株進(jìn)行基于腸桿菌基因間重復(fù)共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的分析,并根據(jù)分離株的年份、地域及ERIC-PCR基因型選取13個(gè)代表菌株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)的分析。結(jié)果 92 株Salmonella分離株的ERIC-PCR的指紋圖譜均在250bp處得到沙門(mén)菌屬的特異性擴(kuò)增條帶;71株S.derby指紋圖譜的相似系數(shù)在0.74～1.00之間,可分為6個(gè)基因型,其中Ⅰ和Ⅲ型為優(yōu)勢(shì)基因型,分別占了 54.93%(39/71)和 19.72%(14/71);21 株S.agona指紋圖譜的相似系數(shù)在0.68～1.00之間,可分為6個(gè)基因型,其中基因型A(28.57%,6/21)和B(33.33%,7/21)為優(yōu)勢(shì)基因型;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),同一市場(chǎng)里不同種類(lèi)的肉品存在同一Salmonella的污染、同一市場(chǎng)里同種類(lèi)的肉品存在不同的Salmonella的污染、同一市場(chǎng)里不同采樣時(shí)間的同種類(lèi)肉品存在同一Salmonella的污染等情況;MLST基因分型的研究結(jié)果表明,7株S.derby均為ST40(19-20-3-20-5-22-22)、6 株 S.agona 均為 ST13(3-3-7-4-3-3-7)。本課題還對(duì)71株S.derby進(jìn)行包括萘啶酸、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星5種常用喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥性研究。首先,通過(guò)常規(guī)藥敏紙片(K-B)法對(duì)菌株進(jìn)行耐藥表型的檢測(cè),然后對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)之 qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-lb-cr、oqxA、oqxB、qepA共7種基因分別進(jìn)行PCR檢測(cè),并對(duì)gyrA和parC基因的喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)進(jìn)行測(cè)序并分析其氨基酸位點(diǎn)突變情況,最后將耐藥表型與耐藥基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示,71株受試S.derby對(duì)第一代的喹諾酮類(lèi)藥物萘啶酸之耐藥性嚴(yán)重,耐藥率為19.72%、不敏感率為43.66%;對(duì)第三代的環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星敏感(敏感率分別為71.83%、74.65%、70.42%),但其中介率也比較高(分別為23.94%、25.35%、25.35%);對(duì)第四代的加替沙星則最敏感(敏感率為84.51%),中介率為14.08%。有76.06%(54/71)的菌株檢測(cè)到了 PMQR基因,其中oqxA檢出率最高(53.52%)、oqxB檢出率次之(49.30%)、qnr與aac(6')-Ib-cr的檢出率相近,分別為 29.58%(21/71)、25.35%(18/71),qnrA與qnrB基因檢出率較低,分別為4.23%(3/71)、5.63(4/71),未檢測(cè)到qepA基因;攜帶2種PMQR基因菌株的的百分比最高,占菌株數(shù)的 32.39%(23/71),有 12.68%(9/71)、11.27%(8/71)的菌株分別攜帶3種、4種PMQR基因,oqxA和oqxB兩種基因與對(duì)萘啶酸耐藥的表型符合率較高,都達(dá)到了 70%以上,aac(6')-lb-cr和qnrS基因的符合率都在40%左右;14株對(duì)萘啶酸耐藥的菌株中,有92.86%(13/14)的菌株在gyrA或parC兩個(gè)基因共檢測(cè)到21個(gè)氨基酸突變位點(diǎn),其中g(shù)yrA的D87N和S83I兩個(gè)位點(diǎn)突變分別有35.71%(5/14)和 21.43%(3/14),parC的主要位點(diǎn)突變?yōu)?T57S(42.86%,6/14)和 T57V(21.43%,3/14)。本課題研究結(jié)果證明,廣西地區(qū)生鮮肉源Salmonella基因型呈現(xiàn)多樣性,表明Salmonella的污染源廣泛;ERIC-PCR分型技術(shù)可用于生鮮肉污染的Salmonella之溯源;Salmonella對(duì)喹諾酮類(lèi)的耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重,gyrA和parC基因的位點(diǎn)突變是Salmonella對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制,而PMQR基因的攜帶也是Salmonella產(chǎn)生耐藥的一個(gè)重要機(jī)制。
【圖文】：

邐ｆ邐ＩＩ逡逑圖２－１邋７１株鮮肉源如分離株遺傳關(guān)系聚類(lèi)樹(shù)狀圖逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅｔｉｃ邋ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ邋ｏｆ邋７１邋５＊．邋ｄｅｒｂｙ邋ｉｓｏ

Ｆｉｇ．２－３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｏ邋Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ邋ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ邋ｇｅｎｅｓ逡逑：邋ＤＬ２邋０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ａｒｏＣ；邋２：邋ｄｎａＮ＼邋３：邋ｈｅｍＤ；邋４：邋ｈｉｓＤ＼邋５：邋ｐｕｒＥ＼邋６：邋ｓｕｃＡ＼邋７：邋ｔｈｒＡ逡逑對(duì)于上述個(gè)管家基因膠回收目的片段交由北京六合華大基因科技有限公司逡逑測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)整理后上傳國(guó)際網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（ｈｔｔｐｓ：／／ｍ邋１邋ｓｔ．Ｗａｒｗｉｃｋ．ａｃ．ｕｋ）。逡逑數(shù)據(jù)庫(kù)中各管家基因比對(duì)得出結(jié)果如圖２－４、圖２－５所示：７株逡逑辦均為邋ＳＴ４０（邋１９－２０－３－２０－５－２２－２２邋），其相關(guān)基因型有：ＳＴ３９、ＳＴ６７８、ＳＴ８１８、逡逑２０，；６邋株邋Ｓ．邋ａｇｏｒｎｚ邋均為邋ＳＴ１３（３－３－７－４－３－３－７），其相關(guān)基因型有：ＳＴ３７、ＳＴ６７４、逡逑６、ＳＴ６７７。各菌株具體信息見(jiàn)表２－４。逡逑［１９邋ｌＥｏ－邋ＩｆｉＴ邋＂ＩｆｉｃＴ邋］［Ｆ￣邐２２邐￣１邋（２２逡逑ＳＴ４０邐１９邐２０邐３邐２０邐５邐２２邐２２邐５７逡逑ＳＴ３９邐１９邐２０邐３邐２０邐５邐２邐２２邐５７逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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6 劉U，

本文編號(hào)：2653539