【摘要】：旋毛蟲病是最重要的食源性人畜共患疾病之一,分布于世界各地。旋毛蟲病不僅會造成重大經(jīng)濟損失,還危及人類健康。本實驗利用RNA干擾技術(shù)探究旋毛蟲谷氨酰胺依賴性抗酸機制的重要性。通過浸泡法將三條特異性的TsGLS-siRNA導(dǎo)入旋毛蟲肌幼蟲,篩選出一條沉默效果最佳的TsGLS-siRNA;將轉(zhuǎn)染siRNA的肌幼蟲放在pH2.5、pH4、pH6.6、pH9的培養(yǎng)液中,從存活率、基因表達水平、蟲體酶活性、培養(yǎng)液pH變化、Gln缺失等檢測TsGLS基因沉默對肌幼蟲耐酸能力的影響;將轉(zhuǎn)染siRNA的肌幼蟲經(jīng)口接種小鼠,觀察TsGLS基因沉默對肌幼蟲胃液內(nèi)耐酸能力、肌幼蟲減蟲率以及子一代耐酸能力的影響。通過基因水平和蛋白水平分析,siRNA-881組肌幼蟲TsGLS表達量比PBS組分別降低72.82%和55.44%,成功從三條TsGLS-siRNA篩選出干擾效果最佳的siRNA-881。TsGLS基因沉默對肌幼蟲體外抗酸能力影響檢測中,存活率結(jié)果顯示,在pH2.5、2 h時存活率明顯低于其他酸性環(huán)境下,siRNA-881組肌幼蟲減蟲率僅為PBS對照組的48.33%。蟲體酶活性檢測結(jié)果顯示,在pH2.5、0.5 h時谷氨酰胺酶活性最高,為1.67 U/mg,pH4次之,pH9時沒有活性。培養(yǎng)液pH變化結(jié)果顯示,通過pH計測量培養(yǎng)溶液的pH值,并且當(dāng)培養(yǎng)溶液起始pH為pH4時,pH變化最顯著。在pH4環(huán)境中培養(yǎng)1 h,與PBS組相比,siRNA-881干擾后pH值上升低了1.7,且隨著時間增長,差距越小。通過檢測谷氨酰胺的缺失對抗酸能力的影響,結(jié)果顯示,體外添加10μM谷氨酰胺能提高TsGLS基因表達,且siRNA-881沉默TsGLS效果好于BPTES。TsGLS基因沉默對肌幼蟲體內(nèi)抗酸能力影響檢測中,用轉(zhuǎn)染siRNA的肌幼蟲接種小鼠后,檢測7 d成蟲減蟲率和35 d肌幼蟲減蟲率分別為61.64%和66.71%。檢測其保姆細(xì)胞厚度結(jié)果顯示,與PBS組相比,siRNA-881組(15.90±1.301)厚度降低了39.78%。siRNA處理肌幼蟲TsGLS基因沉默遺傳性分析,與親代相比,子一代的基因表達量較親代降低32.70%。由此證明,旋毛蟲具有谷氨酰胺依賴性抗酸系統(tǒng),利用RNA干擾技術(shù)也已明顯降低肌幼蟲抗酸能力。為了評價旋毛蟲TsGLS、TsGAD重組蛋白誘導(dǎo)小鼠的免疫保護效果,分別將TsGLS、TsGAD、TsGLS+TsGAD重組蛋白分別與佐劑混勻免疫BALB/c小鼠后,檢測血清中特異性抗體水平的變化,并檢測重組蛋白體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平;在加強免疫小鼠后,通過攻擊試驗檢測并比較7天成人和35天肌肉幼蟲的蠕蟲減少率,以及免疫小鼠在攻蟲后第7、14、21、35天產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平。血清中特異性抗體檢測結(jié)果顯示,用TsGLS和TsGAD重組蛋白免疫的小鼠可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生混合的Th1/Th2免疫應(yīng)答,每個免疫組血清中IgG、IgG_1、IgG_(2a)檢測結(jié)果顯示,IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗體水平均有所增加,且以IgG_1(Th2)的抗體水平增加最顯著。增殖實驗結(jié)果表明,經(jīng)TsGLS和TsGAD重組蛋白刺激后,脾淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加,以TsGAD重組蛋白刺激最顯著。ELISA檢測培養(yǎng)液中細(xì)胞因子分泌情況結(jié)果顯示,IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10含量均顯著增加。ELISA檢測血清中細(xì)胞因子結(jié)果顯示,IL-4和IL-10的水平在攻擊后第14天達到最高水平,IFN-γ和IL-12水平在攻蟲后第7天達到最高。攻蟲試驗結(jié)果顯示,TsGLS、TsGAD和TsGLS+TsGAD小鼠中的成蟲和肌肉幼蟲為35.55%、49.24%、37.34%和47.05%、60.01%、46.55%。上述研究結(jié)果表明,TsGLS和TsGAD重組蛋白均能誘導(dǎo)小鼠獲得免疫保護效果,且TsGAD重組蛋白免疫效果最佳。兩部分實驗表明,旋毛蟲肌幼蟲具有谷氨酰胺依賴性抗酸系統(tǒng),利用RNA干擾技術(shù)也已明顯降低肌幼蟲抗酸能力,為預(yù)防旋毛蟲病提供了一條新思路。谷氨酰胺酶可以作為一種候選旋毛蟲病疫苗。
【圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文果 siRNA 導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)浸泡法將熒光標(biāo)記的 Control siRNA 轉(zhuǎn)染到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)，并分別在 顯微鏡觀察。圖 3-1 中顯示，6 h 時只有少量肌幼蟲有熒光信號，12 h 時轉(zhuǎn)上，說明浸泡 12 h 后，Control siRNA 已經(jīng)被成功導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體到實驗標(biāo)準(zhǔn)。在熒光顯微鏡下明顯觀察到熒光信號主要集中于旋毛蟲小腸ol siRNA 可能為旋毛蟲吞食進入體內(nèi)。

-2 siRNA 處理后旋毛蟲肌幼蟲 TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平xpression level of TsGLS in Trichinella spiralis muscle treatmentot 在蛋白水平檢測 siRNA 對 TsGLS 表RNA-881、siRNA-1429 分別轉(zhuǎn)染到肌幼蟲體內(nèi)，在平檢測。與 PBS 對照組相比，siRNA-419、siRNA別降低 7.74%、55.44%、35.52%，而 Control siRNA組（P>0.05），見圖 3-3。siRNA-881 對 TsGLS 表達 檢測 TsGLS mRNA 表達量結(jié)果相一致。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.7

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本文編號：2648373