【摘要】：毛發(fā)是哺乳動(dòng)物最為顯著的外在特征之一,是由嵌入皮膚內(nèi)的迷你器官—毛囊所產(chǎn)生。毛囊主要由真皮層和表皮層兩類細(xì)胞構(gòu)成,其中屬于真皮層的毛乳頭細(xì)胞是毛囊的“信號(hào)中心”,它們通過分泌諸多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等信號(hào)分子控制著毛囊表皮層細(xì)胞的增殖和分化。屬于表皮層的毛母質(zhì)細(xì)胞是形成毛發(fā)各類細(xì)胞的前體細(xì)胞,它們是在毛囊干細(xì)胞被激活后遷移到毛囊毛球部所形成的細(xì)胞群體,其快速增殖和終末分化最終形成持續(xù)不斷生長(zhǎng)的毛發(fā)。絨山羊是我國(guó)重要的絨毛用經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一,探索毛囊發(fā)育的分子機(jī)制是提高絨毛產(chǎn)量和質(zhì)量的基礎(chǔ)性工作。因此,了解毛乳頭細(xì)胞信號(hào)分子表達(dá)調(diào)控和毛母質(zhì)細(xì)胞增殖及分化的相關(guān)機(jī)理是解析毛囊發(fā)育的關(guān)鍵科學(xué)問題。本研究旨在獲取毛乳頭細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù),并探索毛乳頭細(xì)胞和毛母質(zhì)細(xì)胞間信號(hào)互作的分子機(jī)制,為上述科學(xué)問題的解決提供參考信息。本研究?jī)?nèi)容共包括:1)分離培養(yǎng)絨山羊毛囊毛乳頭細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,建立起兩類細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),通過比較分析篩選影響毛囊發(fā)育的編碼基因和非編碼基因;2)探索與篩選到的功能基因CRABP1和LEPR相關(guān)的小分子物質(zhì)全反式視黃酸和瘦素在毛乳頭細(xì)胞內(nèi)的功能;3)建立并優(yōu)化毛母質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的技術(shù)體系;4)通過細(xì)胞共培養(yǎng)和RNA-seq技術(shù)探索毛乳頭細(xì)胞和毛母質(zhì)細(xì)胞分子互作的機(jī)制。主要研究成果如下:1.成功地采用顯微解剖法和組織塊培養(yǎng)法分別獲取了絨山羊的毛乳頭細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞;兩類細(xì)胞具有顯著不同的形態(tài)特征,毛乳頭細(xì)胞呈扁平狀和多角形,而成纖維細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)的紡錘絲狀;對(duì)兩類細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組學(xué)建譜共鑒定到mRNAs43766條,lncRNAs 2540條,TUCP 759條,miRNAs 536條,circRNAs 3706條。2.毛乳頭細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共存在差異表達(dá)mRNAs 2538條,其中毛乳頭細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)1286條,下調(diào)1252條;lncRNAs 71條,其中上調(diào)18條,下調(diào)53條;TUCP18條,上調(diào)3條,下調(diào)15條;circRNAs 121條,上調(diào)76條,下調(diào)45條;miRNAs86條,上調(diào)42條,下調(diào)44條;對(duì)毛乳頭細(xì)胞中上調(diào)的基因及差異表達(dá)非編碼基因的靶基因進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),粘附斑、胞外基質(zhì)-受體互作和調(diào)節(jié)干細(xì)胞多潛能性信號(hào)通路等信號(hào)通路得到富集。同時(shí),雌激素信號(hào)通路、脂肪因子信號(hào)通路和甲狀腺激素信號(hào)通路等與激素相關(guān)的信號(hào)通路也得到富集。3.將絨山羊毛乳頭細(xì)胞上調(diào)基因同小鼠毛乳頭細(xì)胞的標(biāo)記基因取交集分析發(fā)現(xiàn)25個(gè)核心基因,包括SPP1、LEPR、WNT5A、PTGFR、RSPO1、HOXC8和MAGED2等;進(jìn)一步對(duì)涉毛囊干細(xì)胞激活相關(guān)的基因HOXC8和RSPO1進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),它們的表達(dá)可能受到chi-miR-144-5P、lnc_000335和lnc_001710等非編碼基因的正向和負(fù)向調(diào)控;同時(shí),一些特定的lncRNAs和circRNAs如XR_310320.3和chi_circ_000573可能會(huì)作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNAs分子吸附抑制上述基因表達(dá)的miRNAs如chi-miR-144-5P等從而上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)。4.視黃酸信號(hào)通路相關(guān)基因CRABP1和RARβ高表達(dá)于毛乳頭細(xì)胞內(nèi);外源性的全反式視黃酸抑制毛乳頭細(xì)胞的活力,誘導(dǎo)毛乳頭細(xì)胞的凋亡,增加毛乳頭細(xì)胞處于細(xì)胞周期G1期的比例,而減少G2期比例;全反式視黃酸處理后毛乳頭細(xì)胞中CRABP1和RARβ的表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05),而FGF7表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.05);全反式視黃酸在轉(zhuǎn)錄水平抑制FGF7的表達(dá),且RARβ在FGF7基因啟動(dòng)子區(qū)域存在8個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。LEPR的mRNA和蛋白表達(dá)水平在毛乳頭細(xì)胞中都顯著地高于成纖維細(xì)胞;外源重組瘦素處理提高了毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞活力,同時(shí)也顯著地增加了FGF7和IGF-1的表達(dá)量(P0.05)。5.成功地采用顯微解剖法分離培養(yǎng)了絨山羊毛母質(zhì)細(xì)胞,原代和傳代培養(yǎng)的毛母質(zhì)細(xì)胞都呈典型的角質(zhì)化細(xì)胞樣的鋪路石狀形態(tài);對(duì)培養(yǎng)條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn),無鈣RPMI1640是最優(yōu)的培養(yǎng)基,而Coating Matrix和Collagen Type IV是最優(yōu)的培養(yǎng)皿包被介質(zhì);毛母質(zhì)細(xì)胞的體外倍增時(shí)間為23.60小時(shí);毛母質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記基因如HOXC13和SOX21等的表達(dá)在mRNA和蛋白水平顯著地高于毛乳頭細(xì)胞(P0.05)。6.鈣離子促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞內(nèi)角質(zhì)化細(xì)胞分化相關(guān)基因loricrin、involucrin和KRT1的表達(dá),提高了毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖比例,但對(duì)細(xì)胞周期沒有影響。全反式視黃酸促進(jìn)了毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖,減少毛母質(zhì)細(xì)胞處于細(xì)胞周期G1期的比例,而增加了處于G2期和S期的比例;全反式視黃酸增加了毛母質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CRABP1和RARβ的表達(dá)量(P0.05),也促進(jìn)了involucrin基因的表達(dá)(P0.05)。7.Transwell直接共培養(yǎng)改變了毛乳頭細(xì)胞和毛母質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期分布,體現(xiàn)在共培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞處于S期的細(xì)胞比例顯著地高于單獨(dú)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞(P0.05)。同時(shí),共培養(yǎng)的毛母質(zhì)細(xì)胞處于G1期細(xì)胞比例顯著減少(P0.05),G2期和S期顯著增加(P0.05)。8.共培養(yǎng)改變了兩類細(xì)胞的基因表達(dá)模式,體現(xiàn)在共培養(yǎng)條件下毛乳頭細(xì)胞上調(diào)基因3358個(gè),包括已知的功能基因如FGF7、FGF10、WNT5A和IL-6等,下調(diào)基因2843個(gè)。共培養(yǎng)時(shí)毛母質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因3436個(gè),包括誘導(dǎo)毛乳頭細(xì)胞表達(dá)生長(zhǎng)因子的基因IL-1A等;下調(diào)基因3059個(gè),包括編碼角蛋白的基因如KRT17等和對(duì)角蛋白表達(dá)起調(diào)控作用的基因如HOXC13等。綜上所述,本研究通過對(duì)毛乳頭細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組建譜和分析篩選到了大量影響毛囊生長(zhǎng)和發(fā)育的候選編碼和非編碼基因,并構(gòu)建了非編碼基因?qū)﹃P(guān)鍵編碼基因的調(diào)控關(guān)系和互作網(wǎng)絡(luò);通過挖掘相關(guān)數(shù)據(jù),本研究探索了全反式視黃酸和瘦素對(duì)毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)的作用,為進(jìn)一步闡述它們對(duì)毛囊的影響提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí),本研究還成功地建立并優(yōu)化了毛母質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系,并借此探索了毛乳頭細(xì)胞和毛母質(zhì)細(xì)胞體外互作的分子機(jī)制,為進(jìn)一步探索毛囊發(fā)育的分子機(jī)制提供良好的細(xì)胞模型和可靠的候選基因。
【圖文】：

圖 1-1 哺乳動(dòng)物毛囊形態(tài)發(fā)生的一般過程及關(guān)鍵分子(Schmidt-Ullrich and Paus 200Figure 1-1 Processes and the key molecules of the morphogenesis of animal hair follicle通過以小鼠為模型進(jìn)行基因敲除或敲入等基因操作，研究人員發(fā)現(xiàn)了大量的發(fā)生相關(guān)的信號(hào)分子及通路如 Wnt/β-catenin、Eda/Edar、FGFs、TGFβ/B13 等(Millar 2002; Stenn 2003; Madaan et al. 2018)。K14 基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 路抑制因子 Dkk1 的異位表達(dá)會(huì)導(dǎo)致毛囊形態(tài)轉(zhuǎn)變和細(xì)胞分化之前的基板形而且還阻止了類似毛囊的結(jié)構(gòu)如牙齒和乳腺在毛芽階段之前的發(fā)育(And)。Edar 基因的突變也有類似的效應(yīng)，會(huì)致使小鼠毛發(fā)在形態(tài)發(fā)生過程中沒成，機(jī)制是導(dǎo)致基板特異性基因如 Bmp4、Lef1 和 Shh 等的表達(dá)缺失(Laurik02)。此外，Lef1、Noggin、Shh 和 Gli2 等都與毛囊的形態(tài)發(fā)生過程有密切的它們?cè)诿倚螒B(tài)發(fā)生不同階段所起的作用是不同的(Zhou et al. 1995; Chian; Botchkarev et al. 2002; Mill 2003)。類似的機(jī)制也出現(xiàn)在絨山羊毛囊的發(fā)育過Gao等(2016)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)不同階段絨山羊胎兒皮膚的基因表達(dá)譜現(xiàn)，HOXC13、LHX2、MSX2 和 PAD3 等同小鼠毛囊角質(zhì)化細(xì)胞分化相關(guān)的羊毛囊發(fā)育的不同階段差異性表達(dá)，說明這些基因都也參與了絨山羊毛囊發(fā)

圖 1-2 毛囊周期循環(huán)示意圖(Alonso 2006)Figure 1-2 The hair cycle1.2 毛乳頭細(xì)胞研究進(jìn)展毛乳頭細(xì)胞是位于毛囊底部的一類特化的成纖維細(xì)胞，，它們?cè)诿倚螒B(tài)發(fā)生和周期循環(huán)中有舉足輕重的作用，被認(rèn)為是毛囊的“信號(hào)中心”(Karlsson et al. 1999; Kulessa eal. 2000)。它們不僅決定著毛囊的周期性發(fā)育，還影響著毛囊的大小及毛發(fā)纖維的粗細(xì)等(Yano et al. 2001; Driskell et al. 2012; Morgan 2014)。毛乳頭細(xì)胞也可以作為許多激素、神經(jīng)小肽、小分子化合物及神經(jīng)遞質(zhì)等諸多小分子物質(zhì)的靶標(biāo)，進(jìn)而間接性地參與這些激素類物質(zhì)對(duì)毛囊周期的調(diào)控(Oh and Smart 1996b; van Beek et al. 2008; Paus et al. 2014Toyoshima and Tsuji 2017)。此外，困擾人類群體的雄性脫發(fā)疾病也與毛乳頭細(xì)胞促進(jìn)毛囊角質(zhì)化細(xì)胞的增殖和分化功能的缺失有關(guān)(Inui et al. 2002, 2003; Inui and Itam2011)。因此，毛乳頭細(xì)胞參與毛囊生物學(xué)各個(gè)方面的分子機(jī)制得到研究人員廣泛的關(guān)注(Madaan et al. 2018)。同時(shí)，研究人員也建立起了毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)的技術(shù)體系，
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S827


本文編號(hào)：2647287