【摘要】：試驗開展了犬C-反應蛋白(C-CRP)熒光微球免疫層析定量方法的研究,旨在研制一種操作簡易、靈敏度高,用于快速定量檢測C-CRP熒光免疫層析試紙條。采用雙抗體夾心法和熒光免疫層析技術(shù),以羧基熒光微球標記的抗C-CRP單克隆抗體及羊抗雞IgY為標記抗體,抗C-CRP單克隆抗體和雞IgY分別作為檢測線和質(zhì)控線制備熒光免疫層析試紙條。結(jié)果顯示,所制備C-CRP檢測試紙條的檢測范圍為0.5～250mg/L,檢測限為0.5mg/L,批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別為0.68%～6.94%和0.89%～8.79%,平均回收率為98.15%～101.19%,試劑與9種干擾物質(zhì)無交叉反應。加速破壞穩(wěn)定性試驗表明試紙條可以常溫放置24個月。臨床樣本測試發(fā)現(xiàn),其與I-CHROMA試劑盒檢測結(jié)果相關性良好(R2=0.995)。綜上所述,該熒光免疫層析試紙條靈敏度、特異度較高,且操作簡單、快速,可用于寵物犬臨床檢測。
【圖文】：

ＨＲＯＭＡ）試劑盒檢測２３３例犬隨機血液樣本，�。泊沃貜偷钠骄�，比較檢測結(jié)果相關性。２結(jié)果２．１抗體標記濃度對微球熒光強度的影響濃度為０．０１ｍｇ／ｍＬ不同標記量的熒光微球經(jīng)熒光光譜儀連續(xù)掃描，最大激發(fā)波長為４６９ｎｍ，最大發(fā)射波長為５２７ｎｍ，說明微球在檢測時激發(fā)光和發(fā)射光更容易分開，降低了背景干擾的幾率。原熒光微球和偶聯(lián)抗體濃度為０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｍｇ／Ｌ的免疫熒光微球發(fā)射光譜見圖１。由圖１可知，熒光微球偶聯(lián)不同濃度的抗體發(fā)射光譜的峰型規(guī)則，與偶聯(lián)前有相同的峰位，發(fā)射譜峰未見偏移，熒光強度未有明顯的降低。表明熒光微球的發(fā)射光譜的位置與抗體的標記量無關，偶聯(lián)過程中微球光學性質(zhì)基本沒有改變。但熒光微球偶聯(lián)過程中，可能會有損失，造成熒光微球光學強度略微下降，且隨著偶聯(lián)抗體量的增加，熒光微球光學強度也會稍微降低。圖１不同抗體濃度標記微球的熒光強度Ｆｉｇ．１Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ２．２熒光微球掃描電鏡圖譜熒光微球的掃描電鏡圖譜見圖２。由圖２可知，微球粒度均一，并且偶聯(lián)抗體后未引起微球的團聚。免疫熒光微球表面有明顯的蛋白分子層，呈均勻分散狀態(tài)，表明抗體標記效果良好。３２６

中國畜牧獸醫(yī)４６卷Ａ，原熒光微球；Ｂ，免疫熒光微球Ａ，Ｏｒｉｇｉｎａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；Ｂ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ圖２免疫熒光微球掃描電鏡圖譜（１００００×）Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｍａｐｐｉｎｇｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（１００００×）２．３Ｃ－ＣＲＰ熒光定量免疫層析試紙條的標準曲線依次測定濃度為０、２．５、６、１５、２０、４８、１００、２５０ｍｇ／Ｌ的標準品Ｔ／Ｃ值，重復１０次，以熒光信號Ｔ／Ｃ值為Ｙ軸，標準品濃度的對數(shù)值為Ｘ軸擬合標準曲線，，結(jié)果見圖３。由圖３可知，Ｃ－ＣＲＰ標準方程為：Ｙ＝１．１００８３－０．２４９１６Ｘ＋１．０４５１Ｘ２（Ｒ２＝０．９９９７），曲線擬合度較好。２．４檢測范圍及靈敏度將濃度為０的標準品１０次測定的熒光值均值加２倍標準偏差代入Ｙ＝１．１００８３－０．２４９１６Ｘ＋１．０４５１Ｘ２（Ｒ２＝０．９９９７）中，得到試劑盒檢測限為０．５ｍｇ／Ｌ，試劑分析靈敏度較高，試劑檢測范圍為０．５～２５０ｍｇ／Ｌ。２．５精密度抽�。矀�批次的Ｃ－ＣＲＰ檢測試劑，分別對Ｃ－ＣＲＰ濃度為５、５０、２５０ｍｇ／Ｌ標準品進行檢測，結(jié)果見表１。由表１可知，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為０．６８％～６．９４％和０．８９％～８．７９％，批內(nèi)與批間各檢測濃度變異系

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5 王文s

本文編號：2643911