【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的高度傳染性、出血性疾病(Liess et al.1987)。E2蛋白是豬瘟病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白,也是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原。基于其很好的免疫原性,且能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的病毒中和抗體,E2蛋白是CSF亞單位疫苗及相關(guān)檢測(cè)技術(shù)開發(fā)理想的候選抗原。畢赤酵母表達(dá)體系具有分泌表達(dá)、真核修飾等優(yōu)點(diǎn),是E2蛋白理想的表達(dá)系統(tǒng)。本研究以豬瘟病毒E2蛋白胞外區(qū)基因?yàn)槟０?構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA-E2,并通過電轉(zhuǎn)化獲得畢赤酵母X-33菌陽性克隆,經(jīng)SDS-PAGE、western-blot鑒定篩選出E2蛋白表達(dá)菌株。通過探究誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH、誘導(dǎo)劑濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間使E2蛋白在搖瓶達(dá)到最佳表達(dá)量。將培養(yǎng)基上清進(jìn)行Ni NTA親和層析、離子交換等純化方法獲得較純E2蛋白,對(duì)其糖基化修飾、二聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;并將純化的蛋白免疫動(dòng)物,根據(jù)血清學(xué)試驗(yàn)分析蛋白免疫原性。結(jié)果表明,豬瘟病毒E2蛋白在畢赤酵母中成功分泌表達(dá),且表達(dá)的E2蛋白為二聚體結(jié)構(gòu),具有糖基化修飾。血清學(xué)分析表明該蛋白具有良好的免疫原性。本研究為豬瘟病毒亞單位疫苗、單克隆抗體篩選及相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。總體實(shí)施方案主要分為以下幾個(gè)部分:1.pPICZαA-E2載體構(gòu)建參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中豬瘟病毒兔化弱毒疫苗E2蛋白的氨基酸序列(GenBank:AF531433),截取E2(345 aa)序列胞外區(qū)基因,將E2序列克隆至pPICZαA載體。PCR鑒定及質(zhì)粒測(cè)序表明重組載體構(gòu)建成功。2.電轉(zhuǎn)化與酵母單克隆篩選提取質(zhì)粒pPICZαA-E2,經(jīng)PmeI酶切線性化后回收,經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)量為6.14μg,可用于電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束至酵母單克隆形成后,無菌挑取菌落至5 mL YPD液體培養(yǎng)基中30°C、220 rpm振蕩培養(yǎng)24 h,進(jìn)行菌液PCR鑒定,結(jié)果表明挑取的克隆PCR均為陽性。3.CS FV E2蛋白的表達(dá)及純化將PCR鑒定陽性菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),取第3 d培養(yǎng)基上清1 mL,用Ni NTA填料4°C過夜富集,western-blot鑒定結(jié)果表明重組E2蛋白表達(dá)成功。分別設(shè)置不同pH誘導(dǎo)培養(yǎng)基,不同誘導(dǎo)時(shí)間,不同誘導(dǎo)劑濃度,在誘導(dǎo)時(shí)間為5 d、誘導(dǎo)劑濃度為0.5%、培養(yǎng)基pH為3或4時(shí)蛋白表達(dá)量最高;確定蛋白純化中洗雜液、洗脫液的濃度,確定了最佳純化方法。4.E2蛋白活性分析采用斑點(diǎn)雜交(dot-blot)試驗(yàn)檢測(cè)E2蛋白活性,dot-blot試驗(yàn)方法改進(jìn)自Sithigorngu(1991)。取干燥硝酸纖維素膜(NC膜),將樣品1μL量點(diǎn)樣于膜上,60°C烘干,浸入0.25%戊二醛30 min,用ddw(雙蒸水,double distilled water)洗三遍后將膜浸泡在含5%脫脂奶的PBST中室溫封閉2 h。分別孵育一抗與相應(yīng)的二抗,顯色并觀察。結(jié)果表明豬瘟陽性豬血清能很好的識(shí)別E2蛋白。5.蛋白結(jié)構(gòu)鑒定取純化好的E2蛋白10μg用肽N-糖苷酶F(PNGase-F)處理,于12%SDS-PAGE跑膠并轉(zhuǎn)膜,分析去糖基化程度。將純化的蛋白進(jìn)行非還原(non-ruducing)處理,通過western blot分析蛋白二聚體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明E2蛋白具有糖基化修飾,以二聚體形式存在。6.免疫學(xué)活性分析將純化的E2蛋白與弗氏完全佐劑按1:1混合并乳化,作為一免用免疫原。E2蛋白與弗氏不完全佐劑按1:1乳化,作為二免用免疫原。分別免疫兔子與小鼠,每7 d采血并制備血清,-20°C凍存用于血清學(xué)分析。兔血清豬瘟抗體阻斷率為92.5%,小鼠血清豬瘟抗體阻斷率為58.0%,IPMA試驗(yàn)結(jié)果表明小鼠血清能與豬瘟病毒反應(yīng)。本研究的意義在于成功建立CSFV重組E2蛋白X-33畢赤酵母表達(dá)體系,獲得了高純度E2蛋白,對(duì)其糖基化修飾與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定,并對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。這些研究結(jié)果表明畢赤酵母表達(dá)的CSFV重組E2蛋白免疫原性良好。為豬瘟新型亞單位疫苗的研究、單克隆抗體的篩選及豬瘟檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)提供了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：2641976